基于人工染色体 技术的人g基因 的导入
基于人工染色体 技术的人Ig基因 的导入
染色体是基图的天然载体 1.人工染色体 定义：人工合成的，能在生物细胞中独立、稳定存在和遗传的人工重组 DNA分子，它至少应具备三种功能元件的类似组份：复制原点(origin of replication)、着丝点(centromere)和端粒子(telomere) 容量巨大，远超现有基因工程载体 目的基图与他两侧的基图或序列是天然的遗传 连顿，对目的基因有强火的保护作用 ■染色体工程的关能特点 一充分模拟天然染 色体对大片段基因信息的携带及 保护能力
染色体是基因的天然载体 目的基因与他两侧的基因或序列是天然的遗传 连锁，对目的基因有强大的保护作用 n染色体工程的关键特点 -充分模拟天然染 色体对大片段基因信息的携带及 保护能力。 1.人工染色体 定义：人工合成的，能在生物细胞中独立、稳定存在和遗传的人工重组 DNA 分子,它至少应具备三种功能元件的类似组份： 复制原点(origin of replication)、着丝点(centromere)和端粒子(telomere) 容量巨大，远超现有基因工程载体
染色体三大元件 Euchromatin Heterochromatin Centromere Telomere Exogenous DNA Heterochromatin 端粒重复序列(telomeric repeat,TEL)：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不被胞内 的核酸酶降解，以形成稳定的结构。 着丝粒(centromere,GE0：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到 子细胞中。在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。 自主复制序列(autonomously repl ication sequences,ARS)一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行 双向复制所必须的信号
端粒重复序列（telomeric repeat ， TEL）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内 的核酸酶降解，以形成稳定的结构。 着丝粒（centromere ， CEN）：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点， 使染色体在分裂过程中能正确分配到 子细胞中 。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。 自主复制序列（autonomously replication sequences，ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行 双向复制所必须的信号。 染色体三大元件
2.YAC一一酵母人工染色体 容量巨大 构建文库 ●酵母人工染色体克隆载 YAC载体主要是用来构建 体的特点： 大片段DNA文库，特别 能容纳长达1000kb甚 用来构建高等真核生物的 至3000kb的外源DNA 基因组文库，往往一个 片段。特别适合针对抗 YAC载体可以容纳一个完 体基因复杂大片段的转 整的基因，并不用作常规 移 的基因克隆
2.YAC——酵母人工染色体 容量巨大 l 酵母人工染色体克隆载 体的特点： 能容纳长达 的外源DNA 片段。特别适合针对抗 体基因复杂大片段的转 移 构建文库 YAC 载体主要是用来 ，特别 用来构建高等真核生物的 基因组文库， ，并不用作常规 的基因克隆
3.YAC染色体的应用 3.1人类基因组建库 构建基因文库 抗体基因属于超大基因，而且轻链和 重链位于不同的基因位点，通过YAC 文库可以钓取和重组完整的抗体基因 片段 人基人基因的数目估计为5~10万多个，平均因 每30~50kb含有一个基因，因此一个YAC克 童毫雪中中妈 隆即可能包含一个完整的基因·换言之，用任一 基因旁或基因内的片段为探针便能筛选到含这 一基因的YAC克隆
人基人基因的数目估计为5～10万多个，平均因 每30~50kb含有一个基因，因此一个YAC克 隆即可能包含一个完整的基因．换言之，用任一 基因旁或基因内的片段为探针便能筛选到含这 一基因的YAC克隆. 3.1 人类基因组建库 抗体基因属于超大基因，而且轻链和 重链位于不同的基因位点，通过YAC 文库可以钓取和重组完整的抗体基因 片段 3.YAC染色体的应用
应 人NA CEN SUP4 ARS IRP PYAC- URA3 11454bp a中p TEL RI部分消化 YAC构 TEL HIS PFGE BarnHI 分离 建示意 BoHI /EcoRI 威酸酌 图 左臂 右臂 插入IDNA URA3
YAC构 建示意 图
3.YAC染色体的应用 Formation of plasmid with target gene 3.2大片段基因的转移和表达 代处列列 AATTC D digest G■ CTTAA target DNA e.g.with EcoR sticky ends EcoRI site 利用染色体超大容量和高稳定性保存 6 AATTC 遗传信息的能力。 EcoRI plasmid 将大片段基因信息转移到宿主细胞 ligase 并能够随着宿主细胞的增殖和分裂 继续留存。 plasmid with target inserted
利用染色体超大容量和高稳定性 遗传信息的能力。 将大片段基因信息 到宿主细胞 ，并能够随着宿主细胞的增殖和分裂 继续留存。 3.YAC染色体的应用 3.2 大片段基因的转移和表达
酵母人工染色体载体（YAC) 这种人工染色体克隆载体 ARSI EcoRI 实际上是一种“穿梭”克隆载 CEN4 体，含有质粒克隆载体所必备 TRPI 的第一受体（大肠杆菌）源质粒 复制起始位点(ori),还含有 Ap PYAC4 URA3 第二受体（如酵母菌）染色体 DNA着丝点、端粒和复制起始 位点的序列，以及合适的选择 ori 标记基因。 TEL BamHI TEL
这种人工染色体克隆载体 实际上是一种“穿梭”克隆载 体，含有质粒克隆载体所必备 的第一受体(大肠杆菌)源质粒 复制起始位点(ori)，还含有 第二受体(如酵母菌)染色体 DNA着丝点、端粒和复制起始 位点的序列，以及合适的选择 标记基因。 酵母人工染色体载体（YAC）
第一受体 第二受体 酵母人工染 色体载体 这种克隆载体在 这样的克隆载体 (YAC) 体外与目的DNA 在第一受体细胞 (大肠杆菌)内 片段重组后，转 化第二受体细胞 可以按质粒复制 (酵母)，可在 形式进行高拷贝 复制。 转化的细胞内按 染色体DNA复制 WPS 的形式进行复制 和传递
酵母人工染 色体载体 （YAC） WPS 第一 受 体 第 二 受 体 这样的克隆载体 在第一受体细胞 （大肠杆菌）内 可以 。 这种克隆载体在 体外与目的DNA 片段重组后，转 化第二受体细胞 （酵母），可在 转化的细胞内按 染色体DNA复制 的形式进行复制 和传递
4.染色体的分离技术 ·细胞培养 ·秋水仙碱处理细胞使其处于分裂中期 ·低渗处理，加皂苷，破裂细胞 ·TMS液处理，离心，收集染色体 ·染色体储存于含20%甘油的缓冲液中
• 细胞培养 • 秋水仙碱处理细胞使其处于分裂中期 • 低渗处理，加皂苷，破裂细胞 • TMS液处理，离心，收集染色体 • 染色体储存于含20％甘油的缓冲液中 4.染色体的分离技术