第六章病毒病毒（Virus）是在19世纪末才被发现的一类微小病原体。随着研究的深入，现代病毒学家已把病毒这类非细胞生物分成真病毒(Euvirus，简称病毒）和亚病毒(subvirus)两大类：真病毒：至少含有核酸和蛋白质两种组分非细胞生物《类病毒：只含具有独立侵染性的RNA组分亚病毒拟病毒：只含不具独立侵染性的RNA组分脱病毒：只含单一蛋白质组分第一节病毒病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显微“非细胞生物”，其本质是一种只含DNA或RNA的遗传因子，它们能以感染态和非感染态两种状态存在。在宿主体内时呈感染态（活细胞内专性寄生），依赖宿主的代谢系统获取能量、合成蛋自白质和复制核酸，然后通过核酸与蛋白质的装配而实现其大量紧殖：在离体条件下，它们能以无生命的生物大分子状态长期存在，并可保持其侵染活性。具体地说，病毒的特性有：①形体极其微小，一般都能通过细菌滤器，故必须在电镜下才能观察：②没有细胞构造，其主要成分仅为核酸和蛋白质两种，故又称“分子生物”；③每一种病毒只含一种核酸，不是DNA就是RNA；既无产能酶系，也无蛋白质和核酸合成酶系，只能利用宿主活细胞内现成代谢系统合成自身的核酸和蛋白质组分：③以核酸和蛋白质等“元件”的装配实现其大量繁殖；③在离体条件下，能以无生命的生物大分子状态存在，并可长期保持其侵染活力；③对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感；③有些病毒的核酸还能整合到宿主的基因组中，并诱发潜伏性感染。由子病毒是专性活细胞内的寄生物，因此，凡在有细胞的生物生存之处，都有与其相对应的病毒存在，这就是病毒种类多样性的原因。至今，各种生物中，都发现有各种相应的病毒存在。病毒与人类的关系密切，如病毒病；发酵工业中的噬菌体（细菌病毒)污染；生物防治剂：生物学基础研究和基因工程中的重要材料或工具。一、病毒的形态构造和化学成分(一)病毒的大小直径多数在100nm(20-200nm)上下，病毒、细菌和真菌个体直径比约为1：10：100。最大的病毒是直径为20onm的牛痘苗病毒(smllpox)，最小病毒之一是脊髓从质炎病毒(poliovirus)，其直径仅为28nm。(二)病毒的形态1.典型病毒粒的构造由于病毒是一类非细胞生物体，故单个病毒个体不能称作“单细胞”，这样就产生了病毒粒或病毒体(virion)这个名词。病毒粒有时也称病毒颗粒或病毒粒子(virusparticle)，专指成熟的、结构完整的和有感染性的单个病毒。病毒粒的基本成分是核酸和蛋白质。核酸位于它的中心，称为核心(core)或基因组（genome)），蛋白质包围在核心周围，形成了衣壳(capsid)。衣壳是病毒粒的主要支架结构和抗原成分，有保护核酸等作用。衣壳是由许多亚单位(subunit)1
1 第六章 病毒 病毒（Virus）是在 19 世纪末才被发现的一类微小病原体。随着研究的深入，现代病毒 学家己把病毒这类非细胞生物分成真病毒(Euvirus，简称病毒)和亚病毒(subvirus)两大类： 第一节 病 毒 病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显微“非细胞生物”，其本质是一 种只含 DNA 或 RNA 的遗传因子，它们能以感染态和非感染态两种状态存在。在宿主体内 时呈感染态(活细胞内专性寄生)，依赖宿主的代谢系统获取能量、合成蛋白质和复制核酸， 然后通过核酸与蛋白质的装配而实现其大量繁殖；在离体条件下，它们能以无生命的生物大 分子状态长期存在，并可保持其侵染活性。 具体地说，病毒的特性有：①形体极其微小，一般都能通过细菌滤器，故必须在电镜下 才能观察；②没有细胞构造，其主要成分仅为核酸和蛋白质两种，故又称“分子生物”；③ 每一种病毒只含一种核酸，不是 DNA 就是 RNA；④既无产能酶系，也无蛋白质和核酸合 成酶系，只能利用宿主活细胞内现成代谢系统合成自身的核酸和蛋白质组分；⑤以核酸和蛋 白质等“元件”的装配实现其大量繁殖；⑥在离体条件下，能以无生命的生物大分子状态 存在，并可长期保持其侵染活力；⑦对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感；⑧有些病毒 的核酸还能整合到宿主的基因组中，并诱发潜伏性感染。 由子病毒是专性活细胞内的寄生物，因此，凡在有细胞的生物生存之处，都有与其相对 应的病毒存在，这就是病毒种类多样性的原因。至今，各种生物中，都发现有各种相应的病 毒存在。 病毒与人类的关系密切，如病毒病；发酵工业中的噬菌体(细菌病毒)污染；生物防治剂； 生物学基础研究和基因工程中的重要材料或工具。 一、病毒的形态构造和化学成分 (一)病毒的大小 直径多数在 100 nm(20-200 nm)上下，病毒、细菌和真菌个体直径比约为 1：10：100。最 大的病毒是直径为 200 nm 的牛痘苗病毒(smllpox)，最小病毒之一是脊髓从质炎病毒(polio virus)，其直径仅为 28nm。 (二)病毒的形态 1. 典型病毒粒的构造 由于病毒是一类非细胞生物体，故单个病毒个体不能称作“单细胞”，这样就产生了病毒 粒或病毒体(virion)这个名词。病毒粒有时也称病毒颗粒或病毒粒子(virus particle)，专指成熟 的、结构完整的和有感染性的单个病毒。病毒粒的基本成分是核酸和蛋白质。核酸位于它的 中心，称为核心(core)或基因组(genome)，蛋白质包围在核心周围，形成了衣壳(capsid)。衣 壳是病毒粒的主要支架结构和抗原成分，有保护核酸等作用。衣壳是由许多亚单位(subunit)
衣壳粒（capsomere或capsomer)所构成。核心和衣壳合称核衣壳（nucleocapsid)，它是任何病毒（指“真病毒”）都具有的基本结构。有些较复杂的病毒，其核衣壳外还被一层含蛋白质或糖蛋白的类脂双层膜覆盖着，这层膜称为包膜(envelope)。包膜中的类脂来自宿主的细胞膜。有的包膜上还长有刺突(spike)等附属物。包膜的有无及其性质与该病毒的宿主专一性和侵入等功能有关。病毒粒的模式构造见图3-1。森森）核衣先衣壳粒（1I）二十面体对称病毒包膜衣壳粒衣壳l核衣壳0O00000OOOOO核酸丁包膜(2)螺旋对称病毒图3-1失病毒粒的模式构造2.病毒粒的对称体制病毒粒的对称体制只有两种，即螺旋对称和二十面体对称（等轴对称）：另一些结构较复杂的病毒，实质上是上述两种对称相结合的结果，故称作复合对称。杆状：烟草花叶病毒（TMV）等无包膜，丝状：大肠杆菌的1、ft、M13噬菌体等螺旋对称卷曲状：正粘病毒（流感病毒）等有包膜弹状：狂犬病毒，水泡性口膜炎病毒等小型：脊髓灰质炎病毒，X174菌体等对称体制无包膜大型：腺病毒等二十面体对称有包膜：疱疹病毒等无包膜：大肠杆菌的T偶数噬菌体（蝌料状）等复合对称有包膜：痘病毒（砖块状）3.病毒的群体形态病毒粒虽是无法用光镜观察的亚显微颗粒，但当它们大量聚集并使宿主细胞发生病变时，就形成了具有一定形态、构造并能用光镜加以观察和识别的特殊“群体”，例如动、植物细胞中的病毒包涵体(inclusionbody)：有的还可用肉眼观察，例如由噬菌体在菌苔上形成的“负菌落”即噬菌班(Plague)，由动物病毒在宿主单层细胞培养物上形成的空斑(plaque)，以2
2 ——衣壳粒(capsomere 或 capsomer)所构成。核心和衣壳合称核衣壳(nucleocapsid)，它是任 何病毒(指“真病毒”)都具有的基本结构。有些较复杂的病毒，其核衣壳外还被一层含蛋白 质或糖蛋白的类脂双层膜覆盖着，这层膜称为包膜(envelope)。包膜中的类脂来自宿主的细 胞膜。有的包膜上还长有刺突(spike)等附属物。包膜的有无及其性质与该病毒的宿主专一性 和侵入等功能有关。病毒粒的模式构造见图 3-1。 2．病毒粒的对称体制 病毒粒的对称体制只有两种，即螺旋对称和二十面体对称(等轴对称)；另一些结构较复 杂的病毒，实质上是上述两种对称相结合的结果，故称作复合对称。 3．病毒的群体形态 病毒粒虽是无法用光镜观察的亚显微颗粒，但当它们大量聚集并使宿主细胞发生病变 时，就形成了具有一定形态、构造并能用光镜加以观察和识别的特殊“群体”，例如动、植物 细胞中的病毒包涵体(inclusion body)；有的还可用肉眼观察，例如由噬菌体在菌苔上形成的 “负菌落”即噬菌班(P1ague)，由动物病毒在宿主单层细胞培养物上形成的空斑(plaque)，以
及由植物病毒在植物叶片上形成的枯斑(lesion，病斑)等。病毒的这类“群体形态”有助于对病毒的分离、纯化、鉴别和计数等实际工作。（三）3类典型形态的病毒及其代表1.螺旋对称的代表一一烟草花叶病毒烟草花叶病毒简称TMV(tobacomosaicvirus)，螺旋对称的典型代表（图3—2)。-蛋白质亚基T4(衣壳粒)2.3病毒RNA10图3-2烟草花叶病毒的模式构造（单位为nm）TMV外形直杆状，长300nm，宽15nm：中空（内径为4nm）。由95%衣壳蛋白和5%单链RNA(ssRNA)组成。衣壳含2130个皮鞋状的蛋白亚基即衣壳粒。每个亚基含158个氢基酸，相对分子质量为17500。亚基以逆时针方向作螺旋状排列，共围130圈（每圈长2.3nm，有16.33个亚基）。SsRNA由6390个核者酸构成，相对分子质量为2X10%，它位于距轴中心4nm处以相等的螺距盘绕于蛋白质外壳内，每3个核苷酸与1个蛋白质亚基相结合，因此，每圈49个核苷酸。由于其核酸有合适的蛋白质衣壳包裹和保护，故结构十分稳定，甚至在室温下放置50年后仍不丧失其侵染力。2.二十面体对称的代表一一腺病毒腺病毒（Adenovirus)是一类动物病毒，1953年首次从手术切除的小儿扁桃体中分离到，至今已发现有100余种，能侵染哺乳动物或禽类等动物。主要侵染呼吸道、眼结膜和淋巴组织，是急性咽炎、咽结膜炎、流行性角膜结膜炎和病毒性肺炎等的病原体。腺病毒的外形呈“球状”，实质上却是一典型的二十面体。没有包膜，直径为70-80nm（图3-3)。它有12个角、20个面和30条棱。衣壳由252个衣壳粒组成，包括称作五邻体(penton)的衣壳粒12个(分布在12个顶角上)，以及称作六邻体(hexon)的衣壳粒240个(均匀分布在20个面上)。每个五邻体上突出一根末端带有顶球的蛋白纤维，称为刺突(spike)。腺病毒的核心是由36500bP(碱基对)的线状双链DNA(dsDNA)构成。3
3 及由植物病毒在植物叶片上形成的枯斑(lesion，病斑)等。病毒的这类“群体形态”有助于 对病毒的分离、纯化、鉴别和计数等实际工作。 （三）3 类典型形态的病毒及其代表 1．螺旋对称的代表——烟草花叶病毒 烟草花叶病毒简称 TMV(tobaco mosaic virus)，螺旋对称的典型代表(图 3—2)。 TMV 外形直杆状，长 300 nm，宽 15nm，中空(内径为 4nm)。由 95％衣壳蛋白和 5％单 链 RNA(ssRNA)组成。衣壳含 2130 个皮鞋状的蛋白亚基即衣壳粒。每个亚基含 158 个氨基 酸，相对分子质量为 17500。亚基以逆时针方向作螺旋状排列，共围 130 圈(每圈长 2．3nm， 有 16.33 个亚基)。ssRNA 由 6390 个核苷酸构成，相对分子质量为 2×106，它位于距轴中心 4nm 处以相等的螺距盘绕于蛋白质外壳内，每 3 个核苷酸与 1 个蛋白质亚基相结合，因此， 每圈 49 个核苷酸。 由于其核酸有合适的蛋白质衣壳包裹和保护，故结构十分稳定，甚至在室温下放置 50 年后仍不丧失其侵染力。 2．二十面体对称的代表——腺病毒 腺病毒(Adenovirus)是一类动物病毒，1953 年首次从手术切除的小儿扁桃体中分离到， 至今已发现有 100 余种，能侵染哺乳动物或禽类等动物。主要侵染呼吸道、眼结膜和淋巴组 织，是急性咽炎、咽结膜炎、流行性角膜结膜炎和病毒性肺炎等的病原体。 腺病毒的外形呈“球状”，实质上却是一典型的二十面体。没有包膜，直径为 70-80 nm(图 3-3)。它有 12 个角、20 个面和 30 条棱。衣壳由 252 个衣壳粒组成，包括称作五邻体 (penton)的衣壳粒 12 个(分布在 12 个顶角上)，以及称作六邻体(hexon)的衣壳粒 240 个(均匀 分布在 20 个面上)。每个五邻体上突出一根末端带有顶球的蛋白纤维，称为刺突(spike)。腺 病毒的核心是由 36500bP(碱基对)的线状双链 DNA(ds DNA)构成
图3-3腺病毒的结构模型3.复合对称的代表一T偶数噬菌体E.coli的T偶数(eventype)噬菌体共有3种，即T2、T4和T6。它们是病毒学和分子遗传学基础理论研究中的极好材料。由于它们的结构极其简单，因此是人类研究得最为透彻的生命对象之一。由图3-4可知，T4由头部(head)、颈部(neck)和尾部(tail)3部分构成。由于头部呈二十面体对称，而尾部呈螺旋对称，故是一种复合对称结构。其头部长95nm，宽65nm，电镜下呈椭圆形二十面体，衣壳由8种蛋白质组成，总含量占76%-81%，它们由212个直径为6nm的衣壳粒组成。头部内有由线状dsDNA构成的核心，长度约50μm，为其头长的650倍，由1.7X105bp构成。头、尾相连处有一构造简单的颈部，包括颈环和颈须2部分。颈环为一六角形的盘状构造，直径37.5nm，其上长有6根颈须，用以裹住吸附前的尾丝。尾部由尾鞘（tail-sheath）、尾管(tail-tube)、基板(base-plate）、刺突(tailpins)和尾丝(tailfibers)5部分组成。尾鞘长95nm，是一个由144个相对分子质量各为55000的衣壳粒缠绕而成的24环螺旋。尾管长95nm：直径为8mm：其中央7L道直径为2.5-3.5mm：是头部核酸基因组)注入宿主细胞时的必经之路。尾管亦由24环螺旋组成，恰好与尾鞘上的24个螺旋环相对应。基板与颈环一样，为一有中央孔的六角形盘状物，直径为3.5nm，上长6个刺突和6根尾丝。刺突长为20nm，有吸附功能。尾丝长140nm.折成等长的2段，直径仅2nm。它由2种相对分子质量较大的蛋白质和4种相对分子质量较小的蛋白质分子构成，能专一地吸附在敏感宿主细胞表面的相应受体上。T4通过尾丝吸附于宿主E.coli表面；吸附后，由于基板受到构象上的刺激，中央孔开口，释放溶菌酶并水解部分细胞壁，接着尾鞘蛋白收缩，把尾管插入宿主细胞中。4
4 3．复合对称的代表——T 偶数噬菌体 E.coli 的 T 偶数(even type)噬菌体共有 3 种，即 T2、T4 和 T6。它们是病毒学和分子遗 传学基础理论研究中的极好材料。由于它们的结构极其简单，因此是人类研究得最为透彻的 生命对象之一。 由图 3-4 可知，T4 由头部(head)、颈部(neck)和尾部(tail)3 部分构成。由于头部呈二十面 体对称，而尾部呈螺旋对称，故是一种复合对称结构。其头部长 95nm，宽 65nm，电镜下 呈椭圆形二十面体，衣壳由 8 种蛋白质组成，总含量占 76％-81％，它们由 212 个直径为 6nm 的衣壳粒组成。头部内有由线状 dsDNA 构成的核心，长度约 50 µm，为其头长的 650 倍， 由 1.7×105bp 构成。头、尾相连处有一构造简单的颈部，包括颈环和颈须 2 部分。颈环为 一六角形的盘状构造，直径 37.5nm，其上长有 6 根颈须，用以裹住吸附前的尾丝。尾部由 尾鞘(tail-sheath)、尾管(tail-tube)、基板(base-plate) 、刺突(tail pins)和尾丝(tail fibers)5 部分 组成。尾鞘长 95nm，是一个由 144 个相对分子质量各为 55000 的衣壳粒缠绕而成的 24 环螺 旋。尾管长 95nm，直径为 8nm，其中央 7L 道直径为 2.5-3.5nm，是头部核酸(基因组)注入 宿主细胞时的必经之路。尾管亦由 24 环螺旋组成，恰好与尾鞘上的 24 个螺旋环相对应。基 板与颈环一样，为一有中央孔的六角形盘状物，直径为 3.5nm，上长 6 个刺突和 6 根尾丝。 刺突长为 20 nm，有吸附功能。尾丝长 140 nm．折成等长的 2 段，直径仅 2nm。它由 2 种 相对分子质量较大的蛋白质和 4 种相对分子质量较小的蛋白质分子构成，能专一地吸附在敏 感宿主细胞表面的相应受体上。 T4 通过尾丝吸附于宿主 E.coli 表面；吸附后，由于基板受到构象上的刺激，中央孔开 口，释放溶菌酶并水解部分细胞壁，接着尾鞘蛋白收缩，把尾管插入宿主细胞中
42收缩鞘65nT基板头部95nm33颈环伸展的尾销(24环）95nm收缩的尾鞘中空的核心（12环）刺突120nm尾丝细菌细胞被膜扩张的基板图3-4K.coli的T4噬菌体模式图左：游离的噬菌体粒了，中：尾部的4处横切面，右：尾销收缩和尾管穿人细菌细胞壁（四）病毒的核酸核酸构成了病毒的基因组(genome)，它是病毒粒中最重要的成分，具有遗传信息的载体和传递体的作用。病毒核酸的种类很多，是病毒系统分类中最可靠的分子基础，主要有以下几个指标：①是DNA还是RNA；②是单链（singlestrand，ss，或称单股）还是双链(doublestrand，ds，或称双股)：③呈线状还是环状；④是闭环还是缺口环：③基因组是单分子、双分子、三分子还是多分子：③核酸的碱基(b，base)或碱基对(basepair，bp)数，以及核苷酸序列等。病毒的核酸类型（表3-1）多种多样。动物病毒以线状的dsDNA和ssRNA为多，植物病毒以ssRNA为主，噬菌体以线状的dsDNA后多，真菌病毒多属于dsRNA病毒。表3-1若干有代表性病毒的核酸类型病毒代表核酸类型动物病毒植物病毒微生物病毒细小病毒线状待发现玉米条纹病毒等H-1(5 176 bp)等SSDNAE.coli的$X174环状待发现待发现和M13噬菌体等DNA单纯疱疹病毒.coli的T系和入线状待发现(1型，152260bp）等(48514bp）晚菌体等dsDNA強猴病毒40花柳菜花叶病毒铜绿假单胞菌的环状(SV40,5224bp)等(8 025 bp)等PM2噬菌荫体等脊髓灰质炎病毒虹豆花叶病毒（2个E.coli的MS2线状SSRNA（7433bp）.艾滋病毒等不同分子共9370bp）等和B噬菌体等RNA呼肠摄病毒（3型，10个各种真菌病毒及假单dsRNA线状玉米矮缩病毒等不同分子共23549bp）等胞菌的6噬菌体等4类病毒及其繁殖方式病毒的种类很多，它们的繁殖方式既有共性又有各自的特点，现以研究得最为深入的E.coli偶数噬菌体为代表，系统地阐述其繁殖过程，再简单地介绍其他病毒的繁殖特点。5
5 （四）病毒的核酸 核酸构成了病毒的基因组(genome)，它是病毒粒中最重要的成分，具有遗传信息的载体 和传递体的作用。病毒核酸的种类很多，是病毒系统分类中最可靠的分子基础，主要有以下 几个指标：①是DNA还是 RNA；②是单链(single strand，ss，或称单股)还是双链(double strand， ds，或称双股)；③呈线状还是环状；④是闭环还是缺口环；⑤基因组是单分子、双分子、 三分子还是多分子；⑥核酸的碱基(b，base)或碱基对(base pair，bp)数，以及核苷酸序列等。 病毒的核酸类型（表 3-1）多种多样。动物病毒以线状的 dsDNA 和 ssRNA 为多，植物 病毒以 ssRNA 为主，噬菌体以线状的 dsDNA 后多，真菌病毒多属于 dsRNA 病毒。 二、4 类病毒及其繁殖方式 病毒的种类很多，它们的繁殖方式既有共性又有各自的特点，现以研究得最为深入的E.coli 偶数噬菌体为代表，系统地阐述其繁殖过程，再简单地介绍其他病毒的繁殖特点
（一）原核生物的病毒一噬菌体噬菌体(phage,bacteriophage)即原核生物的病毒，包括噬细菌体(bacteriophage)、噬放线菌体(actinophage)和噬蓝细菌体(cyanophage)等。它们广泛地存在于自然界，凡有原核生物活动之处几乎都发现有相应噬菌体的存在。噬菌体种类很多，可归纳成6种主要形态：①A型，dsDNA，蝌蚪状，收缩性尾：②B型，dsDNA.蝌蚪状，非收缩性长尾；③c型，dsDNA，非收缩性短尾；④D型，SsDNA，球状，无尾，大顶衣壳粒；③E型，SsRNA，球状，无尾，小顶衣壳粒；③F型，SsDNA，丝状，无头尾（图3-5)。SsRNA$SDNAdsDNA刀0MS2$1174dsRNAfd,M130T3,T7$6元MuT2,T40图3-5噬菌体的基本形态和大小1.噬菌体的繁殖与其他细胞型的微生物不同，噬菌体和一切病毒粒并不存在个体的生长过程，而只有两种基本成分的合成和进一步的装配过程，所以同种病毒粒间并没有年龄和大小之别。噬菌体的繁殖一般分为5个阶段，即吸附、侵入、增殖（复制与生物合成）、成熟（装配）和裂解（释放）。凡在短时间内能连续完成以上5个阶段而实现其繁殖的噬菌体，称为烈性噬菌体(virulentphage)，反之则称为温和噬菌体(temperatephage)。烈性噬菌体所经比的繁殖过程，称为裂解性周期(lyticcycle)或增殖性周期(productivesycle)。现以E.coli的T偶数噬菌体为代表加以介绍（图3-6)。3eD0DNA??①吸附（EsesE?裂解C@成熟②侵入?增殖图3-6烈性喔菌体繁殖的裂解性周期6
6 （一）原核生物的病毒——噬菌体 噬菌体(phage, bacteriophage)即原核生物的病毒，包括噬细菌体(bacteriophage)、噬放线 菌体(actinophage)和噬蓝细菌体(cyanophage)等。它们广泛地存在于自然界，凡有原核生物活 动之处几乎都发现有相应噬菌体的存在。噬菌体种类很多，可归纳成 6 种主要形态：①A 型， dsDNA，蝌蚪状，收缩性尾；②B 型，dsDNA．蝌蚪状，非收缩性长尾；③c 型，dsDNA， 非收缩性短尾；④D 型，ssDNA，球状，无尾，大顶衣壳粒；⑤E 型，ssRNA，球状，无尾， 小顶衣壳粒；⑥F 型，ssDNA，丝状，无头尾(图 3-5)。 1．噬菌体的繁殖 与其他细胞型的微生物不同，噬菌体和—切病毒粒并不存在个体的生长过程，而只有两 种基本成分的合成和进一步的装配过程，所以同种病毒粒间并没有年龄和大小之别。 噬菌体的繁殖一般分为 5 个阶段，即吸附、侵入、增殖(复制与生物合成)、成熟(装配) 和裂解(释放)。凡在短时间内能连续完成以上 5 个阶段而实现其繁殖的噬菌体，称为烈性噬 菌体(virulent phage)，反之则称为温和噬菌体(temperate phage)。烈性噬菌体所经比的繁殖过 程，称为裂解性周期(lytic cycle)或增殖性周期(productive sycle)。现以 E.coli 的 T 偶数噬菌 体为代表加以介绍(图 3-6)
(1)吸吋（absorption，attachment）噬菌体与其相应的特异宿主在水环境中发生偶然碰撞后，如果尾丝尖端与宿主细胞表面的特异性受体（蛋白质、多糖或脂蛋白-多糖复合物等）接触，就可触发颈须把卷紧的尾丝散开，随即就附着在受体上，从而把刺突、基板固着于细胞表面。吸附作用受许多内外因素的影响。(2)侵入（penetration，injection）吸附后尾丝收缩，基板从尾丝中获得一个构象刺激，促使尾鞘中的144个蛋白质亚基发生复杂的移位，并紧缩成原长的一半，由此把尾管推出并插入细胞壁和膜中。此时尾管端所携带的少量溶菌酶可把细胞壁上的肽聚糖水解，以利侵入。头部的核酸迅即通过尾管及其未端小孔注入宿主细胞中，并将蛋白质驱壳留在壁外。从吸附到侵入的时间极短，如T4只需15s。(3)增殖(replication）包括核酸的复制和蛋白质的生物合成。首先，噬菌体以其核酸中的遗传信息向宿主细胞发出指令并提供“蓝图”，使宿主细胞的代谢系统按严密程序、有条不紊地逐一转向或适度改造，从而转变成能有效合成噬菌体所特有的组分和“部件”，其中所需“原料”可通过宿主细胞原有核酸等的降解、代谢库内的贮存物或从外界环境中取得。一旦大批成套的“部件”已合成，就在细胞“工厂”里进行突击装配，于是就产生了一大群形状、大小完全相同的子代噬菌体。由于烈性噬菌体的核酸类型多样，故共复制和生物合成的方式也截然不同。E.coli的T偶数双链DNA噬菌体是按早期(early，immediateearly)、次早期(delayedearly)和晚期(late)基因的顺序来进行转录、转译和复制的图3-7)。子代DNA2343689101112131415卓期基因次早期基因LDNA复制晚期基因1789101112131415123456亲代DNA链?装配出大①早期转录?次早期转录?晚期转录量子代噬菌体早期mRNA次早期mRNA晚期mRNA②早期转译④次早期转译①晚期转译Q000AQ口AAAA00CDo次早期蛋白宿卡原有蛋白早期蛋白晚期蛋白(细菌RNA(DNA 酶, DNA（次早期mRNA(头部蛋白，聚合酶）案合酶,更改蛋聚合,5~羟尾部蛋白，白等)甲基胞嘧啶合装配蛋白，成醇，晚期溶菌酶等)mRNA聚合酶等）图3-7双链DNA噬菌体通过3阶段转录的增过程示意图由图3-7可知，当曦菌体的dsDNA注入宿主细胞后，首先是设法利用宿主细胞内原有的RNA聚合酶转录出噬菌体的mRNA(①)，再由这些mRNA进行转译，以合成噬菌体特有的蛋白质(②)。这一过程称为早期转录(earlytranslation)，由此产生的mRNA称早期mRNA，其后的转译称早期转译(earlytranslation)，而产生的蛋白质则称早期蛋白(earlyproteins)。早期蛋白的种类很多，最重要的是一种只能转录噬菌体次早期基因的次早期mRNA聚合酶（如t7噬菌体）：而在T4等噬菌体中，其早期蛋白则称更改蛋白，特点是它本身并无RNA聚合酶的功能，却可与宿主细胞内原有的RNA聚合酶结合以改变后者的性质，把它改造成只能转录噬菌体次早期基因的酶。至此，噬菌体己能大量合成其自身所需的mRNA。利用早期蛋白中新合成的或更改后的RNA聚合酶来转录噬菌体的次早期基因，借以产生次早期mRNA的过程，称为次早期转录(③)，由此合成的mRNA称为次早期mRNA，进步的转译即为次早期转译（④)，其结果产生了多种次早期蛋白，例如分解宿主细胞DNA-的DNA酶，复制噬菌体DNA的DNA聚合酶，HMC(5一羟甲基胞嘧啶)合成酶，以及供晚7
7 (1)吸咐(absorption, attachment) 噬菌体与其相应的特异宿主在水环境中发生偶然碰 撞后，如果尾丝尖端与宿主细胞表面的特异性受体(蛋白质、多糖或脂蛋白-多糖复合物等) 接触，就可触发颈须把卷紧的尾丝散开，随即就附着在受体上，从而把刺突、基板固着于细 胞表面。吸附作用受许多内外因素的影响。 (2)侵入(penetration, injection) 吸附后尾丝收缩，基板从尾丝中获得一个构象刺激，促 使尾鞘中的 144 个蛋白质亚基发生复杂的移位，并紧缩成原长的一半，由此把尾管推出并插 入细胞壁和膜中。此时尾管端所携带的少量溶菌酶可把细胞壁上的肽聚糖水解，以利侵入。 头部的核酸迅即通过尾管及其末端小孔注入宿主细胞中，并将蛋白质躯壳留在壁外。从吸附 到侵入的时间极短，如 T4 只需 15s 。 (3)增殖(replication) 包括核酸的复制和蛋白质的生物合成。首先，噬菌体以其核酸中 的遗传信息向宿主细胞发出指令并提供“蓝图”，使宿主细胞的代谢系统按严密程序、有条 不紊地逐一转向或适度改造，从而转变成能有效合成噬菌体所特有的组分和“部件”，其中 所需“原料”可通过宿主细胞原有核酸等的降解、代谢库内的贮存物或从外界环境中取得。 一旦大批成套的“部件”已合成，就在细胞“工厂”里进行突击装配，于是就产生了一大群 形状、大小完全相同的子代噬菌体。 由于烈性噬菌体的核酸类型多样，故共复制和生物合成的方式也截然不同。E.coli 的 T 偶数双链 DNA 噬菌体是按早期(early, immediate early)、次早期(delayed early)和晚期(late)基 因的顺序来进行转录、转译和复制的(图 3-7)。 由图 3-7 可知，当噬菌体的 dsDNA 注入宿主细胞后，首先是设法利用宿主细胞内原有 的 RNA 聚合酶转录出噬菌体的 mRNA(①)，再由这些 mRNA 进行转译，以合成噬菌体特有 的蛋白质(②)。这—过程称为早期转录(early translation)，由此产生的 mRNA 称早期 mRNA， 其后的转译称早期转译(early translation)，而产生的蛋白质则称早期蛋白(early proteins)。早 期蛋白的种类很多，最重要的是一种只能转录噬菌体次早期基因的次早期 mRNA 聚合酶(如 t7 噬菌体)；而在 T4 等噬菌体中，其早期蛋白则称更改蛋白，特点是它本身并无 RNA 聚合 酶的功能，却可与宿主细胞内原有的 RNA 聚合酶结合以改变后者的性质，把它改造成只能 转录噬菌体次早期基因的酶。至此，噬菌体己能大量合成其自身所需的 mRNA。 利用早期蛋白中新合成的或更改后的 RNA 聚合酶来转录噬菌体的次早期基因，借以产 生次早期 mRNA 的过程，称为次早期转录(③)，由此合成的 mRNA 称为次早期 mRNA，进 一步的转译即为次早期转译(④)，其结果产生了多种次早期蛋白，例如分解宿主细胞 DNA 的 DNA 酶，复制噬菌体 DNA 的 DNA 聚合酶，HMC(5—羟甲基胞嘧啶)合成酶，以及供晚
期基因转录用的晚期mRNA聚合酶等。晚期转录是指在新的噬菌体DNA复制（③）完成后对晚期基因所进行的转录作用(③)，其结果产生了晚期mRNA。由它再经晚期转译（?）后，就产生了一大批可用于子代噬菌体装配用的“部件”一晚期蛋白，包括头部蛋白、尾部蛋白、各种装配蛋白（约30种)和溶菌酶等。至此，噬菌体核酸的复制和各种蛋白质的生物合成就完成了。(4)成熟（装配）噬菌体的成熟(maturity)过程事实上就是把已合成的各种“部件”进行自装配(selfassembly)的过程。在T4噬菌体的装配过程中，约需30种不同蛋白和至少47个基因参与，其装配过程可见图3-8。主要步骤有：DNA分子的缩合，通过衣壳包裹DNA而形成完整的头部，尾丝和尾部的其他“部件”独立装配完成，头部和尾部相结合后，最后再装上尾丝。24屏.1?VUI图3-8T偶数噬菌体装配过程模式图(5)裂解(释放）当宿主细胞内的大量子代噬菌体成熟后，由于水解细胞膜的脂肪酶和水解细胞壁的溶菌酶等的作用，促进了细胞的裂解(lysis)，从而完成了子代噬菌体的释放(release)。另一种表面上与此相似的现象为一种自外裂解(lysisfromwithout)，是指大量噬菌体吸附在同一宿主细胞表面并释放众多的溶菌酶，最终因外在的原因而导致细胞裂解。自外裂解是决不可能导致大量子代噬菌体产生的。上述增殖的全过程是很快的，如E.coli系噬菌体在合适温度等条件下仅为15-25min。平均每一宿主细胞裂解后产生的于代噬菌体数称作裂解量(burstsize)，不同的噬菌体有所不同，如T2为150左右(5-447)，T4约100。2．噬菌体效价的测定在涂布有敏感宿主细胞的固体培养基表而，若接种上相应噬菌体的稀释液，其中每一噬菌体粒子由于先侵染和裂解一个细胞，然后以此为中心，再反复侵染和裂解周围大量的细胞，结果就会在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的噬菌斑。因每种噬菌体的噬菌斑有一定的形态，故可用作该噬菌体的鉴定指标，也可用于纯种分离和计数。这很像利用菌落进行其他微生物的分离、计数和鉴定那样，所不同的是噬菌体只形成“负菌落”而已。据测定，一个直径仅2mm的噬菌斑，其所含的噬菌体粒子数高达107-109个。效价（titer.titre这一名词在不同的场合有不同的涵义。在这里，效价表示每毫升试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数，又称噬菌斑形成单位数(plaque-formingunit,pfu)或感染中心数(infectivecentre)。测定效价的方法很多，较常用且较精确的方法称为双层平板法(twolayerplatingmethod)。8
8 期基因转录用的晚期 mRNA 聚合酶等。 晚期转录是指在新的噬菌体 DNA 复制(⑤)完成后对晚期基因所进行的转录作用(⑥)，其 结果产生了晚期 mRNA。由它再经晚期转译(⑦)后，就产生了一大批可用于子代噬菌体装配 用的“部件”——晚期蛋白，包括头部蛋白、尾部蛋白、各种装配蛋白(约 30 种)和溶菌酶 等。至此，噬菌体核酸的复制和各种蛋白质的生物合成就完成了。 (4)成熟(装配) 噬菌体的成熟(maturity)过程事实上就是把已合成的各种“部件”进行自 装配(self assembly)的过程。在 T4 噬菌体的装配过程中，约需 30 种不同蛋白和至少 47 个基 因参与，其装配过程可见图 3-8。主要步骤有：DNA 分子的缩合，通过衣壳包裹 DNA 而形 成完整的头部，尾丝和尾部的其他“部件”独立装配完成，头部和尾部相结合后，最后再装 上尾丝。 (5)裂解(释放) 当宿主细胞内的大量子代噬菌体成熟后，由于水解细胞膜的脂肪酶和水解 细胞壁的溶菌酶等的作用，促进了细胞的裂解(lysis)，从而完成了子代噬菌体的释放(release)。 另一种表面上与此相似的现象为一种自外裂解(1ysis from without)，是指大量噬菌体吸附在 同一宿主细胞表面并释放众多的溶菌酶，最终因外在的原因而导致细胞裂解。自外裂解是决 不可能导致大量子代噬菌体产生的。 上述增殖的全过程是很快的，如 E.coli 系噬菌体在合适温度等条件下仅为 15-25min。平 均每一宿主细胞裂解后产生的于代噬菌体数称作裂解量(burst size)，不同的噬菌体有所不同， 如 T2 为 150 左右(5-447)，T4 约 100。 2．噬菌体效价的测定 在涂布有敏感宿主细胞的固体培养基表而，若接种上相应噬菌体的稀释液，其中每一噬 菌体粒子由于先侵染和裂解一个细胞，然后以此为中心，再反复侵染和裂解周围大量的细胞， 结果就会在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的噬菌斑。因每种噬菌体的 噬菌斑有一定的形态，故可用作该噬菌体的鉴定指标，也可用于纯种分离和计数。这很像利 用菌落进行其他微生物的分离、计数和鉴定那样，所不同的是噬菌体只形成“负菌落”而已。 据测定，一个直径仅 2mm 的噬菌斑，其所含的噬菌体粒子数高达 107 -109 个。 效价(titer,titre)这一名词在不同的场合有不同的涵义。在这里，效价表示每毫升试样中 所含有的具侵染性的噬菌体粒子数，又称噬菌斑形成单位数(plaque-forming unit, pfu)或感染 中心数(infective centre)。测定效价的方法很多，较常用且较精确的方法称为双层平板法(two layer plating method)
底层平板（~2%琼脂培养基7~8mL.)37°双层平板法上层培养基（~1.0%琼脂培养基3mL）、计数睦菌斑10余h上层平板宿主菌悬液（对数期菌液0.2mL）混勾1噬菌体试样（合适稀释液0.1ml）双层平板法主要步骤：预先分别配制含2%和1%琼脂的底层培养基和上层培养基。先用底层培养基在培养皿上浇一层平板，待凝固后，再把预先融化并冷却到45℃以下，加有较浓的敏感宿主和一定体积待测噬菌体样品的上层培养基，在试管中摇匀后，立即倒在底层培养基上铺平待凝，然后在37℃下保温：一般经10余h后即可对噬菌斑计数。此法有许多优点，如加了底层培养基后，可弥补培养皿底部不平的缺陷；可使所有的噬菌斑都位于近乎同平面上，因而大小一致、边缘清晰且无重叠现象：又因上层培养基中琼脂较稀，故可形成形态较大、特征较明显以及便于观察和计数的噬菌斑。用双层平板法计算出来的噬菌体效价总是比用电镜直接计数得到的效价低。这是因为前者是计有感染力的噬菌体粒子，后者是计噬菌体的总数（包括有或无感染力的全部个体）。同一样品根据噬菌斑计算出来的效价与用电镜计算出来的效价之比，称成班率(efficiencyofplating,EOP)。噬菌体的成斑率一般均>50%，而动物病毒或植物病毒用类似的方法(如单层细胞空斑法或叶片枯斑法所得的成斑率一般仅10%。3.一步生长曲线定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线，称作一步生长曲线或一级生长曲线(one-stepgrowcurve)。它可反映每种噬菌体(或病毒)的3个最重要的特征参数一—潜伏期(latentphase)、裂解期(risephase)和裂解量(burstsize)，十分重要(图3-9)。XXY1000071X为*一然裂//裂辉解！1000111家人为裂解泊继裂解码国1001潜伏期：裂解期十平稳期裂解量2100010F100=210噬酱体粒子/细菌隐嗨期！20304050感染后时间/min图3-9T4噬菌体的一步生长曲线(1)潜伏期指噬菌体的核酸侵入宿主细胞后至第一个成熟噬菌体粒子装配前的一段时间。它又可分为两段：①隐嗨期(eclipsephase)，指在潜伏期前期人为地(用氯仿等)裂解宿主细胞后，此裂解液仍无侵染性的一段时间，这时细胞内正处于复制噬菌体核酸和合成其蛋白9
9 双层平板法主要步骤：预先分别配制含 2％和 1％琼脂的底层培养基和上层培养基。先用 底层培养基在培养皿上浇一层平板，待凝固后，再把预先融化并冷却到 45℃以下，加有较 浓的敏感宿主和一定体积待测噬菌体样品的上层培养基，在试管中摇匀后，立即倒在底层培 养基上铺平待凝，然后在 37℃下保温；一般经 10 余 h 后即可对噬菌斑计数。此法有许多优 点，如加了底层培养基后，可弥补培养皿底部不平的缺陷；可使所有的噬菌斑都位于近乎同 一平面上，因而大小一致、边缘清晰且无重叠现象；又因上层培养基中琼脂较稀，故可形成 形态较大、特征较明显以及便于观察和计数的噬菌斑。 用双层平板法计算出来的噬菌体效价总是比用电镜直接计数得到的效价低。这是因为 前者是计有感染力的噬菌体粒子，后者是计噬菌体的总数(包括有或无感染力的全部个体)。 同一样品根据噬菌斑计算出来的效价与用电镜计算出来的效价之比，称成班率(efficiency of plating, EOP)。噬菌体的成斑率一般均﹥50％，而动物病毒或植物病毒用类似的方法(如单层 细胞空斑法或叶片枯斑法)所得的成斑率一般仅 10％。 3．一步生长曲线 定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线，称作一步生长曲线或一级生长曲线(one-step grow curve)。它可反映每种噬菌体(或病毒)的 3 个最重要的特征参数——潜伏期(latent phase)、裂解期(rise phase)和裂解量(burst size)，十分重要(图 3-9)。 (1)潜伏期 指噬菌体的核酸侵入宿主细胞后至第一个成熟噬菌体粒子装配前的一段时 间。它又可分为两段：①隐晦期(eclipse phase)，指在潜伏期前期人为地(用氯仿等)裂解宿主 细胞后，此裂解液仍无侵染性的一段时间，这时细胞内正处于复制噬菌体核酸和合成其蛋白
质衣壳的阶段：②胞内累积期（intracellularaccumulationphase)，即潜伏后期，指在隐嗨期后，若人为地裂解细胞，其裂解液已呈现侵染性的一段时间，这意味着细胞内已开始装配噬菌体粒子，并可用电镜观察到。(2)裂解期紧接在潜伏期后的宿主细胞迅速裂解、溶液中噬菌体粒子急剧增多的一段时间。噬菌体或其他病毒粒因只有个体装配而不存在个体生长，再加上其宿主细胞裂解的突发性，因此，从理论上来分析，其裂解期应是瞬间出现的。但事实上因为宿主群体中各个细胞的裂解不可能是同步的，故出现了较长的裂解期。(3)平稳期(plateau）指感染后的宿主细胞已全部裂解，溶液中噬菌体效价达到最高点的时期。一步生长曲线的基本实验步骤为：用噬菌体的稀释液去感染高浓度的宿主细胞，以保证每个细胞所吸附的噬菌体至多只有一个。经数分钟吸附后，在混合液中加入适量的相应抗血清，借以中和尚未吸附的噬菌体，然后用保温的培养液稀释此混合液，同时终止抗血清的作用，随即置于适宜的温度下培养。其间每隔数分钟取样，连续测定其效价，再把结果绘制成图即可。4.溶源性(lysogeny)温和噬菌体(temperatephage)侵入相应宿主细胞后，由于前者的基因组整合到后者的基因组上，并随后者的复制而进行间步复制，因此，这种温和噬菌体的侵入并不引起宿主细胞裂解，此即称溶源性或溶源现象。凡能引起溶源性的噬菌体即称温和噬菌体，而其宿主就称溶源菌(lysogen,lysogenicbacteria)。溶原菌是一类能与温和噬菌体长期共存，一般不会出现有害影响的宿主细胞。温和噬菌体的存在形式有3种：①游离态，指成熟后被释放并有侵染性的游离噬菌体粒子②整合态，指已整合到宿主基因组上的前噬菌体(prophage)状态：营养态，指前噬菌体经外界理化因子诱导后，脱离宿主核基因组而处于积极复制、合成和装配的状态。温和噬菌体十分常见，例如E.coli的2、Mu-1、P1和P2等。其中的入噬菌体是迄今研究得最清楚的一种温和噬菌体，其头呈二十面体（直径为55nm)，有一可弯曲、中空、非收缩性长尾（150×10nm），头、尾间由“颈”连接。核心为线状dsDNA长度为48514bp，约含61个基因)，其两端各有一由12个碱基组成的粘性末端“cos”位点(cohesive-endsite)。当其通过尾部感染宿主时，此线状dsDNA通过两端粘性末端间的配对并在宿主的连接酶作用下发生环化。接着可进入裂解性循环(lytic cycle)或溶源性循环(lysogeniccycle，即整合到宿主的核基因组上，以前噬菌体形式长期潜伏)，这两种循环的相互关系可见图3-10。裂解性循环①+???-?假增梦附浴多次通环源微性播沃同步整X自发或/复合诱导制图3-10裂解性循环与溶源性循环的相互关系在自然界中，各种细菌、放线菌等都有溶源菌存在，例如E.coliK12(2)就是表示一株带有入前噬菌体的大肠杆菌K12溶源菌株。检验溶源菌的方法，是将少量溶源菌与大量的敏感性指示菌（通溶源菌裂解后所释放的温和噬菌体会发生裂解循环者)相混合，然后与琼脂培养基混匀后倒一个平板，经培养后溶10
10 质衣壳的阶段；②胞内累积期(intracellular accumulation phase)，即潜伏后期，指在隐晦期后， 若人为地裂解细胞，其裂解液已呈现侵染性的一段时间，这意味着细胞内已开始装配噬菌体 粒子，并可用电镜观察到。 (2)裂解期 紧接在潜伏期后的宿主细胞迅速裂解、溶液中噬菌体粒子急剧增多的一段时 间。噬菌体或其他病毒粒因只有个体装配而不存在个体生长，再加上其宿主细胞裂解的突发 性，因此，从理论上来分析，其裂解期应是瞬间出现的。但事实上因为宿主群体中各个细胞 的裂解不可能是同步的，故出现了较长的裂解期。 (3)平稳期(plateau) 指感染后的宿主细胞已全部裂解，溶液中噬菌体效价达到最高点的 时期。 一步生长曲线的基本实验步骤为：用噬菌体的稀释液去感染高浓度的宿主细胞，以保证 每个细胞所吸附的噬菌体至多只有一个。经数分钟吸附后，在混合液中加入适量的相应抗血 清，借以中和尚未吸附的噬菌体，然后用保温的培养液稀释此混合液，同时终止抗血清的作 用，随即置于适宜的温度下培养。其间每隔数分钟取样，连续测定其效价，再把结果绘制成 图即可。 4．溶源性(lysogeny) 温和噬菌体(temperate phage)侵入相应宿主细胞后，由于前者的基因组整合到后者的基 因组上，并随后者的复制而进行间步复制，因此，这种温和噬菌体的侵入并不引起宿主细胞 裂解，此即称溶源性或溶源现象。凡能引起溶源性的噬菌体即称温和噬菌体，而其宿主就称 溶源菌(lysogen, lysogenic bacteria)。溶原菌是一类能与温和噬菌体长期共存，一般不会出现 有害影响的宿主细胞。 温和噬菌体的存在形式有 3 种：①游离态，指成熟后被释放并有侵染性的游离噬菌体粒 子；②整合态，指已整合到宿主基因组上的前噬菌体(prophage)状态；③营养态，指前噬菌 体经外界理化因子诱导后，脱离宿主核基因组而处于积极复制、合成和装配的状态。 温和噬菌体十分常见，例如 E.coli 的 λ、Mu-1、P1 和 P2 等。其中的 λ 噬菌体是迄今研 究得最清楚的一种温和噬菌体，其头呈二十面体(直径为 55nm)，有一可弯曲、中空、非收 缩性长尾(150×10nm)，头、尾间由“颈”连接。核心为线状 dsDNA(长度为 48514bp，约含 61 个基因)，其两端各有一由 12 个碱基组成的粘性末端“cos”位点(cohesive-end site)。当 其通过尾部感染宿主时，此线状 dsDNA 通过两端粘性末端间的配对并在宿主的连接酶作用 下发生环化。接着可进入裂解性循环(lytic cycle)或溶源性循环(lysogenic cycle, 即整合到宿 主的核基因组上，以前噬菌体形式长期潜伏)，这两种循环的相互关系可见图 3-10。 在自然界中，各种细菌、放线菌等都有溶源菌存在，例如 E.coli K12(λ)就是表示一株带有 λ 前噬菌体的大肠杆菌 K12 溶源菌株。 检验溶源菌的方法，是将少量溶源菌与大量的敏感性指示菌(通溶源菌裂解后所释放的 温和噬菌体会发生裂解循环者)相混合，然后与琼脂培养基混匀后倒一个平板，经培养后溶