高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因一、实验目的1、学习高效液相色谱仪的操作。2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。二、实验原理咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%。可乐饮料、APC药片等中均含咖啡因。其分子式为CgH1oO2N4，结构式为:CH定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间tr和峰面积A后，可直接用tR定性，用峰面积A作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。三、仪器和试剂1、Agilent1100高效液相色谱仪或上海通微EasySepTM一1010液相色谱仪。2、色谱柱：KromasilC18，5u150×4.6mm。3、流动相：30%甲醇（色谱纯）+70%高纯水：流动相进入色谱系统前，用超声波发生器脱气10min。4、000mg/L咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在110℃下烘干1h。准确称取0.1000g咖啡因，用二次蒸馏水溶解，定量转移至100mL容量瓶中，并稀释至刻度。5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。6、平头微量注射器。四、实验内容1、标准贮备液配制质量浓度分别为20、40、60、80μg·mL-的标准系列溶液
高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因 一、实验目的 1、学习高效液相色谱仪的操作。 2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。 3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。 二、实验原理 咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名 称为 1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为 1.2~1.8%， 茶叶中约含 2.0~4.7%。可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。其分子式为 C8H10O2N4，结构式 为： N N CH3 H3 C O O N N CH3 定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中 的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标 准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱 图上的保留时间 tR和峰面积 A 后，可直接用 tR定性，用峰面积 A 作为定量测定的参数，采用工 作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。 三、仪器和试剂 1、Agilent 1100 高效液相色谱仪或上海通微 EasySepTM－1010 液相色谱仪。 2、色谱柱：Kromasil C18，5µ 150×4.6mm。 3、流动相：30%甲醇（色谱纯）+70%高纯水；流动相进入色谱系统前，用超声波发生器 脱气 10min。 4、 000mg/L 咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在 110℃下烘干 1h。准确称取 0.1000g 咖啡 因，用二次蒸馏水溶解，定量转移至 100mL 容量瓶中，并稀释至刻度。 5、 测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。 6、 平头微量注射器。 四、实验内容 1、 标准贮备液配制质量浓度分别为 20、40、60、80μg·mL-1 的标准系列溶液
2、谱仪器条件：泵的流速：1.0mL/min；检测波长：275nm；进样量：10μL：柱温：室温。3、仪器基线稳定后，进咖啡因标准样，浓度由低到高。4、品处理如下：（1）将约25mL可口可乐置于一100mL洁净、干燥的烧杯中，剧烈搅拌30min或用超声波脱气5min，以赶尽可乐中二氧化碳。（2）准确称取0.04g速溶咖啡，用90℃蒸馏水溶解，冷却后待用。（3）准确称取0.04g茶叶，用20mL蒸馏水煮沸10min，冷却后，将上层清液，并按此步骤再重复一次，将茶叶全部转移至50mL容量瓶中。将上述三种样品分别转移至50mL容量瓶中，并定容至刻度。5、上述三份样品溶液分别进行干过滤（即用干漏斗、干滤纸过滤），弃去前过滤液，取后面的过滤液，备用。6、吴别取5mL可乐、咖啡饮料和茶叶水用0.45um的过滤膜过滤后，注入2mL样品瓶中备用。7、“Agilent1100高效液相色谱仪操作规程”分析饮料试液。五、结果处理1.测定每一个标准样的保留时间（进样标记至色谱峰顶尖的时间）。2.确定未知样中咖啡因的出峰时间。3.求取样品中咖啡因的浓度。序号标样浓度μg·mL保留时间t色谱峰面积S色谱峰高度H2014023608045速溶咖啡6茶叶7可乐六、注意事项1、不同品牌的可乐、茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取的样品量可酌量增减。2、若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。3、为获得良好结果，标准和样品的进样量要严格保持一致。思考题1、用标准曲线法定量的优缺点是什么？2、根据结构式，咖啡因能用离子交换色谱法分析吗？为什么？3、若标准曲线用咖啡因浓度对峰高作图，能给出准确结果吗？与本实验的标准曲线相比何者优越？为什么？
2、 谱仪器条件： 泵的流速：1.0mL/min；检测波长：275nm；进样量：10μL；柱温：室温。 3、 仪器基线稳定后，进咖啡因标准样，浓度由低到高。 4、 品处理如下：（1）将约 25mL 可口可乐置于一 100mL 洁净、干燥的烧杯中，剧烈搅 拌 30min 或用超声波脱气 5min，以赶尽可乐中二氧化碳。（2）准确称取 0.04g 速溶咖啡，用 90℃蒸馏水溶解，冷却后待用。（3）准确称取 0.04g 茶叶，用 20mL 蒸馏水煮沸 10min，冷却 后，将上层清液，并按此步骤再重复一次，将茶叶全部转移至 50mL 容量瓶中。将上述三种样 品分别转移至 50mL 容量瓶中，并定容至刻度。 5、 上述三份样品溶液分别进行干过滤（即用干漏斗、干滤纸过滤），弃去前过滤液，取 后面的过滤液，备用。 6、 别取 5mL 可乐、咖啡饮料和茶叶水用 0.45µm 的过滤膜过滤后，注入 2mL 样品瓶中 备用。 7、 “Agilent 1100 高效液相色谱仪操作规程”分析饮料试液。 五、结果处理 1. 测定每一个标准样的保留时间（进样标记至色谱峰顶尖的时间）。 2. 确定未知样中咖啡因的出峰时间。 3. 求取样品中咖啡因的浓度。 六、注意事项 1、不同品牌的可乐、茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取的样品量可酌量增减。 2、若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。 3、为获得良好结果，标准和样品的进样量要严格保持一致。 思考题 1、用标准曲线法定量的优缺点是什么？ 2、根据结构式，咖啡因能用离子交换色谱法分析吗？为什么？ 3、若标准曲线用咖啡因浓度对峰高作图，能给出准确结果吗？与本实验的标准曲线相比何者优越？为什 么？ 序号 标 样 浓度μg·mL-1 保留时间 tR 色谱峰面积 S 色谱峰高度 H 1 20 2 40 3 60 4 80 5 速溶咖啡 6 茶叶 7 可乐
4、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？5、高效液相色谱柱一般可在室温进行分离，而气相色谱柱则必须恒温，为什么？高效液相色谱柱有时也实行恒温，这又为什么？
4、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？ 5、高效液相色谱柱一般可在室温进行分离，而气相色谱柱则必须恒温，为什么？高效液相色谱柱有时也 实行恒温，这又为什么？