D0I:10.13374/i.issn1001-053x.2013.03.017 第35卷第3期 北京科技大学学报 Vol.35 No.3 2013年3月 Journal of University of Science and Technology Beijing Mar.2013 一种高浓度微生物制剂用于A20生物膜反应器的 挂膜研究 林海)，王校雯12)，董颖博)四，马伟芳2)，韩东梅2) 1)北京科技大学土木与环境工程学院，北京1000832)北京市可持续发展促进会，北京100084 ☒通信作者，E-mail:ybdong(@ustb.edu.cn 摘要针对地埋式污水处理系统的特点，将一种高浓度微生物制剂用于生物膜反应器的挂膜，研究了其在处理模拟家 庭生活污水过程中的启动特性.在进水化学耗氧量、氨氮和总磷分别为750、48和7.5gL-1的条件下，装置运行10d 后，对二者的去除率分别达到85%、58%和35%.光学显微镜、环境扫描电镜观察显示，随着系统的去除率逐渐升而，微 生物的种类也在逐渐改变：聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳的检测结果则表明，火山岩填料和悬浮填料表由生长的 微生物种类较为丰富，虽然不同条件下微生物群落发生了不同程度变化，但是整个微生物系统仍保持相对的稳定性， 关键词污水处理：生物膜：微生物：化学需氧量：脱氨：磷 分类号X703.3 Biofilm culturing of A20 reactors using high concentration microbial agents LIN Hai )WANG Xiao-wen 1.2),DONG Ying-bo),MA Wei-fang 2),HAN Dong-mei2) 1)School of Civil and Environmental Engineering,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China 2)Beijing Association of Sustainable Development,Beijing 100084,China Corresponding author,E-mail:ybdong@ustb.edu.cn ABSTRACT According to the characteristics of a buried sewage treatment system,the start-up of high concentration microbial agents in dealing with analog household sewage was studied in a biofilm reactor.When the chemical oxygen demand,ammonia nitrogen,and total phosphorus are 750,48 and 7.5 mgL,the removal rates of them are 85%,58%, and 35%after operation for 10 d,respectively.Optical microscopy and environmental scanning electron microscopy observations show that with the system removal rate increasing,the microbial species gradually changes.The results of polymerase chain reaction-denature gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE)demonstrate that the microbial species on volcanic rocks and suspended fillers are abundant,and the microbial community changes under different conditions but the whole system of microorganisms maintains relatively stable. KEY WORDS sewage treatment;biofilms;microorganisms;chemical oxygen demand;nitrogen removal;phosphorus 针对小型分散式社区污水处理存在处理效果差染物的目标，主要取决于是否能在生物填料上形成 和微生物挂膜速度慢等问题，本文根据小型污水处 稳定的生物膜。目前，应用较为“泛的挂膜方式 理装置的思路，结合厌氧缺氧-好氧污水处理工艺 是密闭循环法和快速排泥法，但是密闭循环法需 (anaerobic--anoxic--oxic,A2O)和生物膜法的基本原 另设循环池，快速排泥法则需要将接种污泥在与载 理设计了实验室规模的集成式生物膜反应器，其结 体接触之后排出，而且这两种方法均需要预先培养 构紧凑并采用地埋式放置，可适用于单个或多个家接种污泥，而后采用水量或水质逐步提升的运行模 庭排放规模的生活污水处理. 式，从而导致挂膜启动过程工作量大，操作繁琐 生物膜反应器能否达到稳定运行、高效去除污 基于此，近几年国内外在微生物制剂方面进行了大 收稿日期：201203-14
第 卷 第 期 年 月 北 京 科 技 大 学 学 报 入项 一种高浓度微生物制剂用于 生物膜反应器的 挂膜研究 林 海`, 王筱雯,, , 董颖博`回, 马伟芳 , 韩东梅 北京科技大学土木与环境工程学院, 北京 北京市可持续发展促进会, 北京 困 通信作者, · ￡ 摘 要 针对地埋式污水处理系统的特点, 将一种高浓度微生物制剂用于生物膜反应器的挂膜 , 研究 了其在处理模拟家 庭生活污水过程中的启动特性 在进水化学耗氧量 、氨氮和总磷分别为 、 和 ' 一`的条件下, 装置运 行 后, 对三者的去除率分别达到 、 和 光学显微镜 、 环境扫描电镜观察显示, 随着系统的去除率逐渐升高, 微 生物的种类也在逐渐改变 聚合酶链式反应 一变性梯度凝胶电泳的检测结果则表明, 火山岩填料和悬浮填料表面生长的 微生物种类较为丰富, 虽然不同条件下微生物群落发生了不同程度变化, 但是整个微生物系统仍保持相对的稳定性 关键词 污水处理 生物膜 微生物 化学需氧量 脱氮 磷 分类 号 石脚 价 , 叭 万` 爪 。一 `, , 万` 。一乙。`困, 蒯 队 一 即 , 翻 万 。一 、 , 罗 , , , , 困 , , 一 , , , · 一 , , , , 卿 乱 , 一 盯 , , 曲 针对小型分散式社区污水处理存在处理效果差 染物 的 目标 , 主要取决于是否能在生物填料上形成 和微生物挂膜速度慢等 问题 , 本文根据小型污水处 稳定的生物膜 目前 , 应用较为 '一泛 的挂膜 方式 理装置的思路 , 结合厌 氧一缺氧一好氧污水处理工艺 是密闭循环法和快速排泥法 , 但是密 闭循环法需 一 一 , “ 和 生物膜法 的基本原 另设循环池 , 快速排泥法则需要将接种污泥在 , 载 理设计了实验室规模的集成式生物膜反应器, 其结 体接触之后排 出, 而且这两种方法均需要预先培养 构紧凑并采用地埋式放置 , 可适用于单个或多个家 接种污泥, 而后采用水量或水质逐步提升的运行模 庭排放规模的生活污水处理 式 , 从而导致挂膜启动过程工作量大, 操 作繁琐 生物膜反应器能否达到稳定运行 、高效去除污 基于此 , 近几年国内外在微生物制剂方面进行 了大 收稿 日期 刁 一 DOI :10.13374/j .issn1001 -053x.2013.03.017
第3期 林海等：一种高浓度微生物制剂用于A20生物膜反应器的挂膜研究 403. 量的研究上作，取得了一定的成果，它作为能在短 由于该装置是针对分散式家庭生活污水处理， 时间内提供种类卡富、较高活菌量的产品，已经在 需采用较长的排泥周期才能达到管理上的简单易 改善景观水体、治理生活污水和工业废水上得到应 行，其次装置体积包含了停留时间内的污水量以及 用2-刷.利用微生物制剂完成生物膜法的挂膜启动 在清泥周期内污泥的产生量，因此挂膜启动阶段的 既不需要驯化污泥，又可以减少工作量，因此它在 水力停留时间为48h,流量为15Ld-1,污泥同流 挂膜心动方面其有)广泛的应用前景. 比为100%：启动期间，A1、A2、0区的平均溶解 本文采用白行设计的集成式生物膜反应器，分 氧(D0)分别为：0.34、0.18和1.26mgL-1:平均 别以火山岩和悬浮填料作为厌氧和好氧处理的微生 pH分别为6.9、7.2和7.8；反应器内的平均水温为 物载体，以模拟的家庭生活污水为研究对象，重点 21℃，较适应于微生物的生长繁殖. 研究了添加微生物制剂对反应器挂膜启动性能的影 1.2实验用水水质 响，借助环境扫描电镜观察了挂膜后载体上微生物 本实验研究的处理对象是家庭生活污水.所诮 的分布情况，并利用已在微生物分析领域得到广泛 家庭生活污水是指冲厕、厨房、洗澡以及洗涤后的 应用9-12的聚合酶链式反应.变性梯度凝胶电泳 污水，水质特点是碳、氮、磷等含量均高于市政污 (polymerase chain reaction-denature gradient gel elec- 水.由此，根据家庭生活污水的水质特点，本实验采 trophoresis,.PCR-DGGE)技术对不同生长环境下形 用葡萄糖、绵白糖、红糖、氯化铵、磷酸：：氢钾以及 成的微生物群落结构进行了表征，研究成果对丁掌 碳酸氢钠进行家庭生活污水复配模拟.绵白糖和红 握微生物制剂的启动性能，解决小型分散式社区污 糖的加入是避免单一碳源对微生物生长的影响，而 水处理问题具有重要意义. 红糖中含有丰富的微量元素.结合文献和实际检测 1实验材料与方法 的结果，模拟家庭生活污水的成分和水质指标如表 1.1实验装置及工艺流程 1所示. 本实验所使用的反应器综合了活性污泥法的 A20工艺和生物膜原理，采用两级厌氧生物滤池 气提回流 曝气机 加一级好氧移动床的处理，工艺.反应器由四部分组 开升 出水 成（图1）：厌氧一区(A1)、厌氧.区(A2)、好氧区 (0)和沉淀×(S),有效容积分别为9.45、6.93、9.14 生物滤床 悬浮填料 和3.78L,有效水深为300mm.厌氧区内的微生 物载体为直径在15cm的火山岩；好氧区内的微 生物载体为聚乙烯改性的悬浮填料，该填料为空心 圆柱体，内有“十”字叶瓣；A1、A2和O三区域的 厌氧一区厌氧二区好氧区沉淀区 (A1) (A2) (O)(s) 填料填充比分别为35%、55%和45%，填料量约为 3.3、3.8和4.1L:微生物制剂的投加量为每升填料 图1实验装置 0.8g Fig.1 Schematic diagram of the reactor 表1模拟家庭生活污水的成分和水质指标 Table 1 Quality of experimental household sewage 成分 用途 水质指标 葡萄糖/红糖/绵白糖 碳源 进水化学耗氧量(COD)约750mgL-1 氯化铵 氨源 氨氮约48mgL-1 磷酸二氢钾 磷源 总磷约7.5mgL-1 碳酸氢钠 pH调整剂 pH6.37.8 溶解氧5.87.4mgL-1 水温19.421.6℃ 1.3分析方法 行评价.COD的测定采用微波消解-重铬酸御法： 1.3.1水质分析 氨氮采用纳氏试剂分光光度法：总磷采用钼酸铵分 反应器的处理效果通过主要污染物去除率进 光光度法
第 期 林 海等 一种高浓度微生物制剂用于 生物膜反应器的挂膜研究 · · 量的研究 作 , 取得了一定的成果, 它作为能在短 时间内提供种类 丰富 、较高活菌量的产品, 己经在 改善景观水体 、治理生活污水和 「业废水上得到应 用降一 利用微生物制剂完成生物膜法 的挂膜启动 既不需要驯化污泥 , 又 可以减少 作量 , 因此它在 挂膜启动方面具有 ' `泛的应用前景 木文采用 自行设计的集成式生物膜反应器, 分 别以火 山岩和悬浮填料作为厌氧和好氧处理的微生 物载体, 以模拟 的家庭生活污水为研究对象 , 重点 研究了添加微生物制剂对反应器挂膜启动性能的影 响, 借助环境扫描电镜观察了挂膜后载体上微生物 的分布情况, 并利用 已在微生物分析领域得到厂'泛 应用 ”一` 的聚合酶链式反应 一变性梯度凝胶 电泳 一 , 技术对不 司生长环境下形 成的微 生物群落结构进行 了表征 研究成果对 于掌 握微生物制剂的启动性能, 解决小型分散式社区污 水处理问题具有重要意义 由于该装置是针对分散式家庭 生活污水处理, 需采用较长的排泥周期才能达 到管理上 的简 单易 行, 其次装置体积包含 了停留时间 内的污水量 以及 在清泥周期 内污泥的产生量, 因此挂膜启动阶段的 水力停 留时间为 , 流量为 一, 污泥 回流 比为 启动 期间, 、 、 区的平均溶解 氧 分别为 、 和 ·一` 平均 分别为 、 和 反应器 内的平均水温为 ℃, 较适应于微生物 的生长繁殖 实验用水水质 实验材料与方法 实验装置及工艺流程 本实验 所使用的反应器综合 了活性污泥法 的 工艺和生物膜原理, 采用两级厌氧生物滤池 加一级好氧移动床的处理工艺 反应器 由四部分组 成 图 厌氧一区 、厌氧二区 、好氧区 和沉淀 攻 , 有效容积分别为 、 、 和 , 有效水深为 厌氧区内的微生 物载体为直径在 、 的火山岩 好氧 区内的微 生物载体为聚乙烯改性 的悬浮填料, 该填料为空心 圆柱体, 内有 “十 ”字 叶瓣 、 和 三 区域的 填料填充 比分别为 、 和 , 填料量约为 、 和 微生物制剂的投加量 为每升填料 本实验研究的处理对象是家庭 生活污水 所谓 家庭生活污水是指冲厕 、 厨房 、洗澡 以及洗涤后的 污水 , 水质特点是碳 、氮 、磷等含量均 高于市政污 水 由此 , 根据家庭 生活污水的水质特点, 本实验采 用葡萄糖 、绵白糖 、红糖 、氯化馁 、磷酸人氢钾 以及 碳酸氢钠进行家庭 生活污水复配模拟 绵 白糖和红 糖的加入是避免单一碳源对微生物生长的影响, 而 红糖中含有丰富的微量元素 结合文献和实际检测 的结果, 模拟家庭生活污水的成分和水质指标如表 所示 曝气机 悬浮填料 竹 口 匾 二上 大州下门 日日曰 一引 拭 只飞沮 心 。 眨 ` 厌氧一区 厌氧二区 好氧区 沉淀区 图 实验装置 表 模拟家庭生活污水的成分和水质指标 成分 用途 碳源 氮源 磷源 水质指标 葡萄糖 红糖 绵白糖 氯 化钱 磷 酸 二氢钾 碳酸氢钠 调整剂 进水化学耗氧量 约 一 氨氮约 ·一 总磷 约 · 一 、 溶解氧 、 一 水温 滩、 , 分析 方 法 水质分析 反应器 的处理效果通过主要污染物去除率进 行评价 的测定采用微波消解一重铬酸钾法 氨氮采用纳氏试剂分光光度法 总磷采用铝酸钱分 光光度法
404 北京科技大学学报 第35卷 1.3.2生物膜分析 系统对氨氮的去除率稳定在58%左右，认为完成反 采用BA2302显微镜观察悬浮填料的生物相： 应器启动，此时系统对总磷的去除率下降到35%左 采用Quanta200 FEG ESEM环境扫描电镜观察载 右，对总磷的去除量稳定在2.5mgL-1左右.问时 体上的细菌分布 随着反应器的连续运行，黑色的火山岩载体上有黏 生物膜量的测定：取反应器中的填料于坩埚 稠状的乳灰白色物质附着：悬浮填料内侧长有肉眼 中，将坩埚在烘箱中105℃蒸发干，恒重m1.用 能见的淡黄色絮状物，局部形成新生的生物膜：沉 1%NaOH浸泡烘干后的填料，置于70℃的水浴中 淀区底部逐渐堆积有黑色的悬浮污泥，而上部的内 30min并不断搅拌；再用KQ-100M型超声波仪的 壁上附有少量黄色污泥， 超声波处理1min,并搅拌30s:用清水洗去脱落下 图4显示了加入微生物制剂后启动期间COD 来的生物膜，洗去生物膜后，将清洁填料置于坩埚 的去除效果变化情况.见挂膜初期COD的去除 再放入烘箱中在105℃下恒重，得到m2.生物膜质 率较低，仅有55%左右.其原因是：挂膜初期火山 量为m1-m2: 岩和悬浮填料的表面未形成稳定的生物群落，此时 1.3.3PCR-DGGE分析 系统对COD的去除是依靠微生物制剂的活化以及 DNA的提取：取O.8g微生物制剂投加到1 火山岩的吸附作用：之后，随着体系内微生物的稳 L模拟家庭生活污水中，在低曝气量下活化6d, 定增殖，COD的去除率有了明显上升，并几较快达 每天倒去1/2体积的混合液，并补充新制污水至1 到去除率85%的稳定状态 L,最终取100mL混合液.再取载体50mL,加入 60 70 50mL的无菌超纯水，超声处理30min.将各混合 白50 液于10000r-min1离心10min,采用土壤基因组 40 60芒 DNA提取试剂盒. 30 20 50 PCR扩增：上游引物为F341GC:下游引物为 餐 10 R518.采用50uL的反应体系，降落式PCR扩增程 日进水氨氮。出水氨氮·氨氮去除率 0 123456789101112 40 序为94℃、5min,94℃、40s,65℃、60s,72℃、 时间/d 30s:每个循环退火温度降低0.5℃，当温度降至55 图2启动期间氨氮处理效果 ℃后，以该温度扩增15个循环：72℃延伸10min. Fig.2 Removal efficiency of NHg-N during start-up DGGE分析：采用10%聚丙烯酰胺凝胶，变性 梯度为30%~60%，电泳缓冲液为三氨基甲烷-乙酸 10 60 9 电泳缓冲液(Tris acetate-EDTA buffer,,TAE),PCR 50 产物在130V、60℃条件下电泳4h,电泳完成后， 用Gel Red染色40min.微生物群落多样性采用香 40 农指数(Shannon-weaver diversity index,H')以及 3 2 30 辛普森指数(Simpson's index,D)来表征13-14，并 日一进水总磷·一出水总磷·一总磷去除 且利用Sorenson配对相似系数(pairwise similarity 率 0 20 123456789101112 coe伍cient,Cs)比较各样品DGGE指纹图谱间的相 时间/d 似性. 图3启动期间总磷处理效果 2结果与讨论 Fig.3 Removal efficiency of total phosphorus during start-up 2.1微生物制剂对反应器启动性能的影响 综合前述三个指标的去除率，可以看出出水总 启动期间氨氮和总磷的去除效果见图2和图3. 磷和COD达到稳定状态的所需时间(6d)远远低 从图2和图3中可以看出：挂膜初期，制剂中包含 于氨氨(10d),说明硝化菌的世代时间相对较长. 的微生物在适宜的条件下逐渐恢复活性，其数量也 2.2启动过程中微生物相生长变化 成倍增加，此时需要大量的碳、氨、磷等营养物质来 挂膜完成后，经过检测，A1区、A2区和O 供其生长：而后，由于硝化细菌生长缓慢，因此挂膜 区载体上生物量的平均值分别为10.70、16.07和 3d后，系统对氨氮的去除急剧下降，总磷去除率的 22.02gL-1,问时发现A1区和A2区活性生物膜 下降则是体系内微生物稳定生长的结果；10d后， 量随着填料床深度的不同而变化
· · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 卷 系统对氨氮的去除率稳定在 左右 , 认为完成反 应器启动, 此时系统对总磷 的去除率下降到 左 右 , 对总磷的去除量稳定在 ' 一 左右 同时 随着反应器的连续运行, 黑色的火山岩载体上有勃 稠状的乳灰 白色物质附着 悬浮填料 内侧长有 肉眼 能见的淡黄色絮状物, 局部形成新生的生物膜 沉 淀区底部逐渐堆积有黑色的悬浮污泥, 而上部 的内 壁上附有少量黄色污泥 图 显示了加入微生物制剂后启动期 间 的去除效果变化情况 可见挂膜初 期 的 去除 率较低 , 仅有 左右 其原因是 挂膜初期火 山 岩和悬浮填料的表面未形成稳定的生物群落, 此时 系统对 的去除是依靠微生物制剂的活化 以及 火山岩的吸附作用 之后, 随着体系内微生物的稳 定增殖, 的去除率有了明显上升, 并且较快达 到去除率 的稳定状态 哥渔米享 , 。 书进水氨氮 出水氨氮 氨氮去除率 ” ” 二 时间 图 启动期间氨氮处理效果 城碱侧说鸽工崛︵︸︶一切日 、, 一 一 瓣迷来李 二一六过水 一 币水芯象叭 `晕麟洲冰 说啊妈罐睡划︵︸︶助日 生物膜分析 采用 显微镜观察悬浮填料 的生物相 采用 环境扫描 电镜观察载 体上 的细菌分布 生物膜量 的测 定 取反应器 中的填料于柑锅 中, 将柑祸在烘箱 中 ℃蒸发干, 恒重 爪 用 浸泡烘干后的填料 , 置于 ℃的水浴中 并不断搅拌 再用 一 型超声波仪的 超声波处理 , 并搅拌 用清水洗去脱落下 来的生物膜 , 洗去生物膜后, 将清洁填料置于柑锅 再放入烘箱 中在 ℃下恒重, 得到 二 生物膜质 量为 二 一二 分析 的提取 取 微生物制剂投加到 模拟家庭生活污水中, 在低曝气量下活化 , 每天倒去 体积 的混合液 , 并补充新制污水至 , 最终取 混合液 再取载体 , 加入 的无菌超纯水, 超声处理 将各混合 液于 · 一`离心 , 采用土壤基因组 提取试剂盒 扩增 上游引物为 下游引物为 采用 卜 的反应体系, 降落式 扩增程 序为 、 , 、 , ℃、 , 、 每个循环退火温度降低 ℃, 当温度降至 ℃后, 以该温度扩增 个循环 ℃延伸 分析 采用 聚丙烯酞胺凝胶 , 变性 梯度为 、 , 电泳缓冲液为三氨基 甲烷一乙酸 电泳缓冲液 肠 , , 产物在 、 ℃条件下电泳 , 电泳完成后, 用 染色 微生物群落多样性采用香 农指数 一 , ` 以及 辛普森指数 , , 来表征 `一` , 并 且利用 配对相似系数 而 , 比较各样品 指纹图谱间的相 似性 结果与讨论 微生物制剂对反应器启动性 能的影响 启动期间氨氮和总磷的去除效果见图 和图 从图 和 图 中可 以看出 挂膜初期, 制剂中包含 的微生物在适宜的条件下逐渐恢复活性 , 其数量也 成倍增加, 此时需要大量的碳 、氮 、磷等营养物质来 供其生长 而后, 由于硝化细菌生长缓慢 , 因此挂膜 后, 系统对氨氮的去除急剧下降, 总磷去除率的 下 降则是体系 内微生物稳定生长的结果 后 , 时间 图 启动期间总磷处理效果 一 综合前述三个指标的去除率, 可以看 出出水总 磷和 达 到稳定状态 的所需时间 远远低 于氨氮 , 说明硝化菌的世代时间相对较 长 启动过程 中微生物相生长变化 挂膜完成后 , 经过 检测, 区 、 区和 区载体上 生物量 的平均值分别为 、 和 一`, 同时发现 区和 区活性生物膜 量 随着填料床深度的不同而变化
第3期 林海等：一种高浓度微生物制剂用于A0生物膜反应器的挂膜研究 405. 900 100 内部用于物质传递的孔隙 800 90 700 e 图6(a)为好筑区聚乙烯改性填料载体内板的 600 80 表面.发现该载体表面不如火山岩表面沟壑分明， 500 70 400 起伏面较为平滑.图6(b)中显示的是挂膜完成斤， 300 日-进水COD·出水C0D60篷 一COD去除率 填料表面细菌的生长状况.可以看出，好氧区的细 200 菌较为平整地生长在填料表面，有细丝状物质存在 100 40 0 丁生物膜内部，认为好氧区生物膜是在大量的丝状 1 2345 30 789101112 时间/d 菌缠绕在填料表面生长后，其他的细菌附着在丝状 闲形成的骨架上进行大量繁殖，从而形成的， 图4启动期间COD处理效果的变化 好氧生物膜的扫描电镜检测结果显示，悬浮填 Fig.4 Removal efficiency of COD during start-up 料上的生物膜呈黄褐色，随着系统对污水处理效果 图5(a)为伏氧区火山岩载体的表层结构.从图 的逐步提高，微生物的种类也发生改变，由早期 中可以看出火山岩表面沟壑分明，有连通载体内外 的草履虫和线虫这类浮游微生物，逐步发展到后期 的孔道，为微生物的生长提供了阔的比表面积 大量的固着型微生物，如累枝虫和轮虫，且成熟的 图5(b)显示的是挂膜完成后火山岩载体表面微生 生物膜内存在少承丝状菌和大量菌胶团、轮虫和线 物的生长状况.发现大量的细菌附着在起伏不平的 虫，而混合液中存在其他漫游型微生物，如纤毛虫、 载体表面，具有一定的层次，同时清晰可见生物膜 草履虫及颤蚓微型后生动物， (a) b 9细P网四一 图5厌氧区生：物膜的环境描电镜像.(a)火l岩：(b)挂膜后火l岩 Fig.5 Environmental SEM images of biofilms in the anaerobic zone:(a)volcanic rocks;(b)volcanic rocks with biofilms (b) W8m周m 图6好氧区生物膜的环境打描电镜像.(a)聚乙烯：(b)挂膜后聚乙烯 Fig.6 Environmental SEM images of biofilms in the aerobic zone:(a)polyethylene;(b)polyethylene with biofilms
第 期 林 海 等 一种 高浓度微 生物 制剂用 于 “ 生物 膜反应 器 的挂膜研 究 · 研毯名字 匕乃︹︸士川曰 进水 一 出水 一 去除率 硼 留划径崛口一。︵︸︶助已 时问 图 启动 期 间 处理 效果 的变化 一 图 为厌执区火 山岩载体的表层结构 从图 中, 以看出火山岩表面沟壑分明, 有连通载体内外 的孔道 , 为微生物的生长提供 了 '一阔的比表面积 图 显示的是挂膜 完成后火山岩载体表面微 生 物 的生 长状况 发现大量的细菌附着在起伏不 平的 载体表面, 具有一定的层次, 同时 青晰 可见生物膜 内部用 于物质传递的孑隙 图 为好城区聚乙烯 改性填料载体 内板的 表面 发现该载体表面不如火 山岩表面沟壑分明, 起伏面较 为平滑 图 中显示的是挂膜完成后 , 填料表面细 菌的生 长状况 可以看出, 好执 区的细 菌较为平整地生 长在填料表面, 有细丝状物质存在 飞生物膜 内部, 认为好气卜生物膜是在大 鼠的丝状 菌缠绕在填料表面生 长后, 其他的细菌附着在丝状 菌形成的骨架上进 行大 录繁殖, 从而形成的 好氧生物膜的扫描电镜检测结果显示, 悬浮填 料上的生物膜 呈黄褐色, 随着系统对污水处理效果 的逐步提高 , 微生物 的种类 也发生 改变 , 由早 期 的草履虫和线虫这类浮游微生物, 逐步发展到后期 大 最的固着型微生物, 如累枝虫和轮虫, 且成熟的 生物膜 内存在少 最丝状菌和大呈菌胶团 、轮虫和线 虫, 而混合液中存在其他漫游型微生物, 如纤毛虫 、 草履虫及颤叫微型后生动物 甲 翻目二 ” 侧幽 吕哥蕊韶吕哥篇吕 图 厌氧区 `几物膜的环境扫描电镜像 火山岩 挂膜后火门岩 , 了 、 口胭 公翻二 肠口 肠口日口日目 恶恶盈吕吕丢召吕 图 好氧区生物膜的环境扫描电镜像 聚乙烯 挂膜后聚乙烯 · 、 饰
,406 北京科技大学学报 第35卷 2.3细菌群落的多样性分析 四个泳道中条带的位置、灰度以及数日各有不同， 2.3.1DGGE图谱分析 每个样品都有3~4个较亮的条带，表明在不同的反 微生物制剂活化后的样品以及同一时期下从 应区均存在一定数量的优势种群，某些特征种属仅 不同反应区内取得样品的DGGE分离图谱如图 在特定生态条件下存在，随着环境条件的变化，其 7(a)所示.根据DGGE的原理可知，图谱中的每 种群数量也随之改变（如图7(b)中13号条带）：各 一个条带代表一种可能的细菌类群，或者可操作分 样品也存在相同位置但信号强度不同的条带（如图 类单元(operation taxonomy unit,.OTU)l).这些条 7(b)中25号条带)：相对于原始微生物制剂，在不 带明暗程度不同，粗细不一，对应在胶上的密度也 同的反应区也冇新的条带出现（如图7(b)中2和28 不同：泳道内的条带数目越多，说明该泳道对应的 号条带)，表明随着环境条件的变化，出现了新的降 样品中微生物种类越半富：条带亮度越强，表明该 解污染物的微生物种群 种属微生物的数量越多. 2.3.2菌落结构多样性及相似性分析 利用凝胶定量分析软件Quantity One分析图 利用Quantity One软件，结合 谱，得到DGGE的泳道分析图（见图7(b).泳道分 析是以制剂活化后的样品为标尺放在图的左边作为 H=- 参照.从图中可以看出，不同反应区的样品条带数 (1) 不等，粗细灰度不一，所处位置也不同，由此可较 D=1- 为直观地了解各样品中群落的多样性及分布情况. 从图7(b)中可以看出，制剂中微生物种类丰富，条 2j 带数量较多，为18条.比较A1、A2、O和S发现这 Cs=- ×100. a+b (2) (b) 始 3 4 y 5 6 10叶 11+ 234 王 12 王 2 222452878 2 原始A1A20S 100.0%69.2%68.6%66.0%61.4% 图7不同样品的DGGE结果.(a)DGGE分离图谱：(b)DGGE图谱的泳道图 Fig.7 DGGE patterns of different samples:(a)DGGE profile of different samples;(b)DGGE sketch map of different samples
· · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 卷 细菌群落的多样性分析 图谱分析 微生物 制剂活化后 的样 品以及同一 时期 下从 不 同反应 区内取得样 品的 分 离图谱 如图 所示 根据 的原理可知 , 图谱中的每 一个条带代表一种可能的细菌类群, 或者可操作分 类单元 哪 , ` 这些条 带明暗程度不 同, 粗细不一 , 对应在胶上的密度也 不同 泳道 内的条带数 目越多, 说明该泳道对应的 样品中微生物种类越丰富 条带亮度越强, 表明该 种属微生物 的数量越多 利用凝胶定量分析软件 分析图 谱, 得到 的泳道分析图 见图 泳道分 析是以制剂活化后的样品为标尺放在图的左边作为 参照 从图中可 以看出, 不 同反应区的样 品条带数 量不等, 粗细灰度不一, 所处位置也不同, 由此可较 为直观地 了解各样品中群落的 多样性及分布情况 从图 中可以看出, 制剂中微生物种类丰 富, 条 带数量较 多, 为 条 比较 、 、 和 发现这 四个泳道 中条带 的位置 、 灰度 以及数 目各有不 同, 每个样品都有 、 个较亮的条带, 表明在不同的反 应区均存在一定数量的优势种群 某些特征种属仅 在特定生态条件下存在 , 随着环境条件的变 化, 其 种群数量也随之改变 如图 中 号条带 各 样品也存在相 同位置但信号强度不同的条带 如图 中 号条带 相对于原始微生物制剂, 在不 同的反应区也有新的条带出现 如图 中 和 号条带 , 表明随着环境条件 的变化 , 出现 了新的降 解污染物的微生物种群 菌落结构多样性及相似性分析 利用 软件, 结合 一睿资资 一`一睿资' ︸` 任污勺凸甘`︸八 勺心,︸山`自任合兄口内月了一 干牛土不丰十卞 孟,勺自山卫山几了廿自﹄︵ 匕污月` 白`山自 原始 图 不同样品的 结果 分离图谱 图谱的泳道图 即
第3期 林海等：一种高浓度微生物制剂用于AO生物膜反应器的挂膜研究 .407· 可得各样品的SHANNON-Weaver指数(H'和氧交替的状态，导致O区与Al区的相似性程度达 Simpson指数(1/D),结果见表2.根据式(2)得72.0%.虽然S区和0区底部相通，S区的底泥来 到相似系数(Cs),得到各样品之间的相似性矩阵，源」O区填料上脱落的生物膜，但是S区与O区 结果见表3 的微生物群落相似性仅为42.9%，而与A1区的相 微生物群落的卡富度越高，H′指数值越大.从 似性为63.5%，将S区底泥同流到A1区是造成二 表2中可以看山：原始微生物制剂的H最高，而 者相似性较高的原因. O以的H′最低，这说明微生物制剂中包含的微生 3结论 物种类卡富，但随着生长环境的不同，其微生物多 样性也会随之变化，其中由O区的条件较为单 (1)微生物制剂在自行设计的集成式A20生 一，内此它的多样性要劣于其他：五个样品的均匀 物膜反应器的启动具有操作简单、挂膜周期短等 度指数(E)处于同一水平，故变异系数(VarH') 特点，10d即可完成反应器挂膜，此时系统对家 都为0，说明计算得到的多样性指数的可比性很高. 庭生活污水COD、氨氮和总磷的去除率分别达到 Simpson指数(1/D)的特性是，物种越多，物种分 85%、58%和35%，且硝化性能保持稳定 布的均匀程度越高，Simpson指数越大.通过Simp (2)启动实验显示该种微生物制剂活化后样品 son指数的比较可以得到与Shannon-Veaver指数相 Shannon-Weaver指数为2.86，表明制剂可在短时间 问的结果，综合说明原始微生物制剂的生物多样性 内提供数量众多、种类丰富的活性微生物，能够在 最高.因此认为该种微生物制剂能够在较短的时间 填料上形成活性生物量高的生物膜，可满足反应器 内提供数承众多、种类丰富的活性生物量，能够在 快速启动的需求 不问的环境条件下活化，并Ⅱ在填料上形成结构紧 (③)挂膜完成后，不同反应区内的样品与微生 密、活性生物承高的生物膜，无需采用针对性措施， 物制剂之间存有一定数量的共冇种群和特有种群， 既减少了操作工作量，又能够满足反应器快速启动 其中共有种群的数量较高，说明在较短的时间内微 的需求 生物群落结构的演替并不明显，多样性分析结果表 明相同的微生物制剂由于生存环境的单一性（厌氧 表2不同样品的多样性指数 或者好氧)使得其多样性指数也随之降低. Table 2 Diversity indexes of different samples Shannon-Weaver指数 样品 Simpson指数 H E Var H D 1/D 参考文献 原始2.860.99 0 0.05916.840 A1 2.810.99 0 0.061 16.266 [1]Yu H Q,Gu G W.Experimental study on method for bi- A2 2.81 0.99 0 0.061 16.325 0 2.67 0.99 0 0.072 13.884 ological filming of microbial film reactor.China Water S 2.790.98 0 0.064 15.516 Wastewater,1992,8(3):13 (俞汉青，顿国维.生物膜反应器挂膜方法的试验研究中国 表3不同样品的相似矩阵(Cs) 给水排水，1992,8(3)：13) Table 3 Similar matrix of different samples [2 Devaraja T N,Yusoff F M,Shariff M.Changes in bacte- 样品 原始 A1 A2 0 rial populations and shrimp production in ponds treated 原始 100.0 with commercial microbial products.Aquaculture,2002, A1 69.2 100.0 A2 68.6 76.6 100.0 206(3):245 0 66.0 72.0 66.2 100.0 [3]Song S H,Choi SS,Park K,et al.Novel hybrid immobi- 61.4 63.5 57.0 42.9 100.0 lization of microorganisms and its applications to biolog- 相似性阈值的分级标准表明：Cs在26%~50%， ical denitrification.Enzyme Microb Technol,2005,37(6): 轻度相似：Cs在51%~75%，为中度相似：Cs在 567 76%99%,为极相似16.对表3中数据经行分析 [4]Smith D P.Sorptive media biofiltration for inorganic ni- 可以看出：各反应区的微生物群落与原始微生物制 trogen removal from storm water.J Irrig Drain Eng, 2008,134(5):624 剂相似程度低于70%，为中等相似：而两个厌氧反 [5]Liu S F,An D R,Zhang Q F,et al.Study on applica- 应×的微生物群落之间的Cs值为76.6%，为极相 tion of a new type of microbial agent in domestic sewage 似.由进水较高的溶氧量值(5~7mgL-1)和0 treatment.Chin J Environ Eng,2008,2(9):1179 区出水的同流作用，使得A1区的环境处于好氧-缺 (刘双发，安德荣，张勤福，等，新型微生物菌剂在生活污水
第 期 林 海等 一种高浓度微生物制剂用于 生物膜反应器的挂膜研究 · · 可得各样 品 的 指数 ` 和 指数 刀 , 结果见表 根据式 得 到相似系数 , 得到各样况之间的相似性矩阵 , 结果见表 微生物群落 的丰富度越高 , `指数值越大 从 表 中 可以看 出 原始微生物制剂的 , 最高, 而 卜的 `最低 , 这说明微生物制剂中包含的微生 物种类 十富, 但随着生长环境的不同, 其微生物多 样性 也会随之变化 , 其中由一」 区的条件较为单 一, 因此它的多样性要劣于其他 五个样品的均匀 度指数 处于 同一水平, 故变异系数 勺 都为 , 说明计算得到的多样性指数的 可比性很高 指数 的特性 是, 物种越 多, 物种分 布的均匀程度越高, 指数越大 通过 指数的 比较可以得到与 匕 指数相 同的结果, 综合说明原始微生物制剂的生物多样性 最高 因此认为该种微生物制剂能够在较短的时间 内提供数最众多 、种类丰富的活性生物量, 能够在 不同的环境条件下活化, 并且在填料上形成结构紧 密 、活性生物量高的生物膜, 无需采用针对性措施, 既减 少了操作工作量 , 又能够满足反应器快速启动 的需求 氧交替的状态, 导致 区一` 区的相似性程度达 虽然 区和 区底部相通 , 区的底泥来 源于 区填料上脱落 的生物膜 , 但是 区与 区 的微生物群落相似性仅为 , 而与 区 的相 似性为 , 将 区底泥 回流到 区是造成 二 者相似性较高的原因 表 不同样品的多样性指数 飞 结论 微生物制剂在 自行设计的集成式 “ 生 物膜反应器的启动具有操作简单 、 挂膜 周期短等 特点, 即可完成 反应器挂膜 , 此时系统对 家 庭生活污水 、 氨氮和总磷的去除率分别达 到 、 和 , 且硝化性能保持稳定 启动实验显示该种微生物制剂活化后样品 匕 指数为 , 表明制剂可在短时间 内提供数量众多 、种类丰富的活性微生物, 能够在 填料上形成活性生物量高的生物膜 , 可满足反应器 快速启动的需求 挂膜完成后, 不 同反应 区内的样品与微生 物制剂之间存有一定数量 的共有种群和特有种群, 其中共有种群的数量较高 , 说明在较短的时间 内微 生物群落结构的演替并不明显 多样性分析结果表 明相 同的微生物制剂由于生存环境 的单一性 厌氧 或者好氧 使得其多样性指数也随之降低 一人 指数 , 指数 参 考 文 献 工 名 … 今白`︸ 表 不同样品的相似知阵 飞妞 原始 刀 月 , 相似性闽值的分级标准表 明 在 , 轻度相似 在 , 为中度相似 在 、 , 为极相似 对表 中数据经行分析 可以看 出 各反应区的微生物群落 ` 原始微生物制 剂相似程度低 于 , 为中等相似 而两个厌氧反 应区的微生物群落之间的 值为 , 为极相 似 由 飞进水较高的溶氧量值 ' 一 和 卜出水的回流作用 , 使得 区的环境处于好氧一缺 」 , , 几 肠 叨 , , 一 俞汉青, 顾国维 生物膜反应器挂膜方法的试验研究 中国 给水排水, , 【」 , 任 , 仔 ` “ 锐艺廿陀, , 【」 , , , 肠 刁。 械 。 ` 从 , , ” 吃 饭几 召几 , , 【」 , , , · ￡“ 瓜 ￡。。 几夕, , 刘双发, 安德荣, 张勤福 。等 新型微生物菌剂在生活污水
,408 北京科技大学学报 第35卷 处理中的应用研究.环境工程学报，2008,2(9)：1179) (管运涛，宁涛，张丽丽.HRT和载体对-一体化生物膜反应 [6]Zhang Z Y,Li H D,Ma X H,et al.Dominant complex 器脱氮除磷效果的影响.清华大学学报：自然科学版，2009， bacteria in treatment of black and odorous river water. 49(3):359) Environ Sci Technol,2010,33(12):52 [12 Zhao J H,Lou Y,Yu Z S.The microbial community struc- (张宗阳，李捍东，马兴华，等.优势复合菌剂处理黑臭河水 ture and dynamic changes in municipal wastewater treat- 的实验研究.环境科学与技术，2010,33(12)：52) ment plants (A/O).Ecol Environ,2008,17(3):898 [7]Tao F,Gao S,Chen C,et al.Review on treatment of spe- (赵继红，楼燕，余志成.城市污水)'(A/O工艺)微生物群 cial organic industrial wastewater by functional microbes 落结构及其动态变化.生态环境，2008,17(3)：898) and their enzymes.Water Purif Technol 2009,28(1):7 [13]Magurran A E.Ecological Diversity and Its Measurement. (陶芳，高尚，陈诚，等.菌剂及酶制剂在特殊有机工业废水 New Jersey:Princeton University Press,1988 处理中的研究及应用进展.净水技术，2009,28(1)：7) [14 Jia Z H,Yi J H,Su Y R,et al.Diversity comparison of 8 Pan Y Z,Lu W L,Zhang N,et al.Study on purification of soil bacteria communities in rotation and continuous flue- eutrophicated scenery water body by dominant bacterial cured tobacco cropping.Ecol Environ Sci,2010,19(7): agents.Water Wastewater Eng,2005,31(6):73 1578 (潘酒璋，吕雯岚，张娜，等，微生物菌剂净化富营养化景观 (贾志红，易建华，苏以荣，等，烟区轮作与连作上壤细菌群 水体的研究与应用.给水排水，2005,31(6)：73) [9]McSweeney N J,Plumb J J,Tilbury A L,et al.Com- 落多样性比较.生态环境学报，2010,19(7)：1578) parison of microbial communities in pilot-scale bioreac- (15]Su J F,Ma F,Wang H Y,et al.Application of PCR- tors treating Bayer liquor organic wastes.Biodegradation, DGGE to resolve microbial diversity in bio-ceramic reac- 2011,22(2):397 tor.Acta Sci Circumstantiae,2007,27(3):386 [10]Miura Y,Hiraiwa M N,Ito T M,et al.Bacterial com- (苏俊峰，马放，王出字，等.利用PCR-DCGE技术分析 munity structures in MBRs treating municipal wastewa- 生物陶粒硝化反应器中微生物群落动态.环境科学学报， ter:relationship between community stability and reactor 2007,27(3):386) performance.Water Res,2007,41(3):627 [16]Chen JZ,Meng S L,You Y,et al.Characteristic of phy- (11]Guan Y T,Ning T,Zhang LL.Effects of HRT and me- toplankton community in Lake Wuli,Lake Taihu.Ecol dia on nitrogen and phosphorus removal in an integrated Environ Sci,2009,18(4):1358 biofilm reactor.J Tsinghua Univ Sci Technol,2009,49(3): (陈家长，孟顺龙，尤洋，等.太湖五里湖浮游植物群落结构 359 特征分析.生态环境学报，2009,18(4)：1358)
· · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 卷 处理中的应用研究 环境工程学报, , 』 , , , 朗 毗 ”卿 “ 坛 , , 张宗阳, 李捍东, 马兴华, 等 优势复合菌剂处理黑臭河水 的实验研究 环境科学与技术, , 【 创〕 , , , ·环乞 凡 心 , 陶芳, 高尚, 陈诚, 等 菌剂及酶制剂在特殊有机工业废水 处理中的研究及应用进展 净水技术, , 【」 , , , 朗 · 亡。叨 肠 夕, , 潘涌璋, 吕雯岚, 张娜, 等 微生物菌剂净化富营养化景观 水休的研究与应用 给水排水, , 【」 盯 , , , 一 公 勺 忿该。” , , 【 , , , ` 叔 、, 、 · 亡 , , 【 』 , , , 葱叼 饰 乞 、 , , 管运涛, 宁涛, 张丽丽 和载体对一体化生物膜反应 器脱氮除磷效果的影响 清华大学学报 自然科学版, , 【 , , 石 玩 。` 。, , 赵继红。楼燕, 余志展 城市污水 ` 工艺 微生物群 落结构及其动态变化 生态环境, , 』 鳍 叩落 `。。￡, 几 二, 。 即 , 【 』 , , , · 瓜 。`、 。 `, , 贾志红, 易建华, 苏以荣, 等 烟区轮作与连作 上壤细菌群 落多样性比较 生态环境学报, , , , 乙 , 凡 任 · `凸化“川 。亡` , , 苏俊峰, 马放, 王弘宇, 等 利用 凡 技术分析 生物陶粒硝化反应器 中微生物群落动态 环境科学学报, , 【』 , , , 冲 , 肠 ”`。 。 ￡, , 陈家长, 孟顺龙, 尤洋, 等 太湖五里湖浮游植物群落结构 特征分析 生态环境学报,
