Chapter 9 基因操作 (中国医科火学医学遗传学教研室) 第一节、重组DNA技术--基因工程 第二节、基因文库 第三节、分子杂交及相关技术 第四节、DNA多态
1 Chapter 9 基因操作 （中国医科大学医学遗传学教研室 ） 第一节、重组DNA技术---基因工程 第二节、基因文库 第三节、分子杂交及相关技术 第四节、DNA多态
第九章 重点内容提示 ●基因操作，重组DNA技术，原理，步骤 ● 限制性内切酶：命名、识别顺序、切口（平末端， 粘端) ●基因载体(vector),条件，常用载体 ·基因探针，来源 。克隆(clone) ●探针标记方法：nick translation(缺口平移)、随机 。 引物法 ·DNA多态，RFLP,VNTR,STR,微卫星DNA ·PCR方法、原理、应用 ●Southern-Blot:方法、原理、应用 ●Northern-BIot:方法、原理、应用
2 第九章 重点内容提示 ⚫ 基因操作，重组DNA技术,原理,步骤 ⚫ 限制性内切酶：命名、识别顺序、切口（平末端， 粘末端） ⚫ 基因载体（vector）,条件，常用载体 ⚫ 基因探针，来源 ⚫ 克隆(clone) ⚫ 探针标记方法:nick translation (缺口平移)、随机 引物法 ⚫ DNA多态，RFLP ，VNTR，STR ，微卫星DNA ⚫ PCR 方法、原理、应用 ⚫ Southern –Blot:方法、原理、应用 ⚫ Northern-Blot：方法、原理、应用
Chapter 9 基因操作 70年代以来，分子生物学技术迅速发 展起来，使人们有可能进行人类基因 组及单个基因的结构研究，分析其功 能特征，了解其变化规律。分子生物 学技术为揭示人类遗传病的本质起着 重要作用。下面就一些分子生物学技 术以个绍
3 Chapter 9 基因操作 ⚫ 70年代以来,分子生物学技术迅速发 展起来,使人们有可能进行人类基因 组及单个基因的结构研究,分析其功 能特征,了解其变化规律。分子生物 学技术为揭示人类遗传病的本质起着 重要作用。下面就一些分子生物学技 术予以介绍
1996酵母基因组序列 1956HbsGlu-Val 1972重组质粒 1944DNA是遗传物质 1986位置克隆 第一个R酶1983HD病G定位 1946195019551960196519701975198019851990-1995 1949Hbs贫血 1953双螺旋 1966遗传密码 1975DNA杂交 现代分子遗传学发展 1977DNA测序 1981转G小鼠 重要事件 1985PCR 1987G剔除小鼠 1989位置克隆 1990第一个基因治疗 1995细菌G组序列
4 1946 1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 1944DNA是遗传物质 1949Hbs贫血 1953双螺旋 1956HbsGlu-Val 1966遗传密码 第一个R酶 1972重组质粒 1975DNA杂交 1977DNA测序 1981转G小鼠 1983HD病G定位 1985PCR 1986位置克隆 1987G剔除小鼠 1989位置克隆 1990第一个基因治疗 1995细菌G组序列 1996酵母基因组序列 现代分子遗传学发展 重要事件
第一节重组DNA技术基因工程 ● 重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最 重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。 ●重组DNA技术(Recombinant DNA Technique)是人类根据需要选择目的基因 (DNA片段)在体外与基因运载体重组，转 移至号 一细胞或生物体内，以达到改良和创 造新的物种和治疗人类疾病的目的。 ● 这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的 发现和应用
5 第一节 重组DNA技术---基因工程 ⚫ 重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最 重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。 ⚫ 重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）是人类根据需要选择目的基因 （DNA片段）在体外与基因运载体重组，转 移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创 造新的物种和治疗人类疾病的目的。 ⚫ 这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的 发现和应用
一、 限制酶 限制性内切核酸酶restrictive endonucle- ases),又称限制酶。是特异性地切断DNA链 中磷酸二酯键的核酸酶。(“分子手术刀”) ●发现于原核生物体内，现已分离出100多种， 几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组 DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶
6 一、限制酶 ⚫ 限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链 中磷酸二酯键的核酸酶。（“分子手术刀”） ⚫ 发现于原核生物体内，现已分离出100多种， 几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组 DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶
1、限制酶的命名 ·根据其来源命名。如： 属名菌株名 E coRI 种名 编号 ·EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株，I 指在该菌株中分离的第一个限制酶
7 1、限制酶的命名 ⚫ 根据其来源命名。如： 属名 菌株名 E co R I 种名 编号 ⚫ EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I 指在该菌株中分离的第一个限制酶
2、限制酶识别序列和切割形式 ·每种限制酶能识别和切割的通常4~8个核苷酸序列， 称为限制性位点(restriction sites)或切点。 如：HareⅢ5’-GGcC-3' 3'-CCGG-5' BamHⅡ5'-GGATCC-3 3'-CCTAGG-5' 平末端blunt end)对称轴切，连接效果差 切割形式 粘性末端(sticky end)交错切
8 2、限制酶识别序列和切割形式 ⚫ 每种限制酶能识别和切割的通常4~8个核苷酸序列， 称为限制性位点（restriction sites）或切点。 如：Hare III 5’-GGCC- 3’ 3’-CCGG- 5’ Bam HI 5’-GGATCC-3` 3’-CCTAGG- 5’ 平末端(blunt end) 对称轴切，连接效果差 切割形式 粘性末端（sticky end）交错切
Hpe I 5GT-T□AA-c3 3c-AA☒TTHs5 CUT Eco Rl saAA国Ha3 3c-T□THAHAG5 Hind 5A☒A-s-cTT☑3 3HTHCHGHA A5 CUT -CHTHGHCHAG3 3HGAHCHGHTHCF5 CUT Pst I
9
限制性内切核酸酶 5'-GGCC-3 5-GG cc-3' HaeΠ 3-CCGG-5' 3'-CC GG-5 5-GATC-3 5'-GATC- 3 Mbo I 3-CTAG-5 5 3-CTAG-5 5 GGATCC-3' BamHI G 5一GATCC-3 3-CCTAGG-5 3 G一5 CCTAG-5 5-CTGCAG-3 5-CTGCA-3 Pst I G-3 3-GACGTC-5 3’-G 3-ACGTC-5
10 5’ － C T G C A G － 3’ 3’ － G A C G T C － 5’ 5’ － G G A T C C － 3’ 3’ － C C T A G G － 5’ 5’ － G A T C － 3’ 3’ － C T A G － 5’ 5’－ G G 3’－ C C C C － 3’ G G － 5’ 5’ － G G C C － 3’ 3’ － C C G G － 5’ HaeⅢ MboⅠ BamHⅠ PstⅠ 5’ － 3’ － C T A G － 5’ 5’ － G A T C － 3’ － 5’ 5’ － G 3’ － C C T A G － 5’ 5’ － G A T C C － 3’ G － 5’ 5’ － C T G C A － 3’ 3’ － G G － 3’ 3’ － A C G T C － 5’ 限制性内切核酸酶
