第八章植物基因工程体及其构建 ◆第一节植物基因工程敢体种类 ◆第二节根癌农杆菌T质粒的结构与功能 ◆第三节T质粒基因转化机理 ◆四节T质粒的改造及敢体构建 ◆第五节常用选择标记和报告基因
第八章 植物基因工程载体及其构建 第一节 植物基因工程载体种类 第二节 根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能 第三节 Ti质粒基因转化机理 第四节 Ti质粒的改造及载体构建 第五节 常用选择标记和报告基因
植物基因转化系统 ●1载体转化系统(T质粒转化载体、Ri质粒转化载 体、病毒转化载体) ●2.DNA直接导入转化系统(原生质体、基因枪) ●3.种质转化系统(花粉管通道法、生殖细胞浸泡法、 胚囊子房注射法)。 载体转化系统是目前植物基因工程中使用最多 机理最清楚、技术最成熟的、最重要的一种转化系统, 其中又以T质粒转化载体最为重要
植物基因转化系统 l 1.载体转化系统（Ti质粒转化载体、Ri质粒转化载 体、病毒转化载体） l 2. DNA直接导入转化系统（原生质体、基因枪） l 3.种质转化系统（花粉管通道法、生殖细胞浸泡法、 胚囊子房注射法）。 载体转化系统是目前植物基因工程中使用最多、 机理最清楚、技术最成熟的、最重要的一种转化系统, 其中又以Ti质粒转化载体最为重要
第一节植物基因工程载体种类 根据其功能和构建过程,可分为以下种类。 (1)目的基因克隆载体:其功能是保存和克隆目的基因。与 微生物基因工程相似,通常是由多拷贝的E.Coi小质粒为载 体 (2)中间克隆载体:是构建中间表达载体的基础质粒。是由 大肠杆菌质粒插入TDNA片段、目的基因和标记基因等构建 而成。 (3)中间表达载体:是含有植物特异启动子的中间载体。是 构建转化载体的质粒 (4)卸甲载体:是解除武装的T质粒或R质粒,是构建转化 载体的受体质粒。 (5)植物基因转化载体:是最后用于目的基因导人植物细胞 的载体,亦称工程载体。它是由中间表达载体和卸甲载体构 建而成
第一节 植物基因工程载体种类 根据其功能和构建过程，可分为以下种类。 （1）目的基因克隆载体：其功能是保存和克隆目的基因。与 微生物基因工程相似，通常是由多拷贝的E. Coli小质粒为载 体。 （2）中间克隆载体：是构建中间表达载体的基础质粒。是由 大肠杆菌质粒插入T-DNA片段、目的基因和标记基因等构建 而成。 （3）中间表达载体：是含有植物特异启动子的中间载体。是 构建转化载体的质粒。 （4）卸甲载体：是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，是构建转化 载体的受体质粒。 （5）植物基因转化载体：是最后用于目的基因导人植物细胞 的载体，亦称工程载体。它是由中间表达载体和卸甲载体构 建而成
第二节根癌农杆菌T质粒的结构与功 工i质粒的遗传特性、结构及功能 ◆二、TDNA的基因结构与功能 Vi区操纵子的基因结构与功能
第二节 根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能 一、Ti质粒的遗传特性、结构及功能 二、T-DNA的基因结构与功能 三、Vir区操纵子的基因结构与功能
T质粒的遗传特性、结构及功能 ◆1.质粒的遗传特性及类型 i质粒是根癟农杆菌染色体外的遗 传物质,为双股共价闭合的环状DNA分子, 其分子量为95~156×105D,约有200kb 组成。 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成 的冠瘿碱种类不同,Ti质粒可以被分成四 种类型:章鱼碱型( octopine)、胭脂碱型 ( nopaline)、农杆碱型( agropine)和农 杆菌素碱型( agrocinopine)或称琥珀碱 型( succinamopIne)
一、Ti质粒的遗传特性、结构及功能 1. Ti质粒的遗传特性及类型 l Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗 传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子， 其分子量为95～156×106D, 约有200kb 组成。 l 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成 的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四 种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型 (nopaline)、农杆碱型（agropine）和农 杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱 型(succinamopine)
2.T质粒的功能区域 ◆T质粒可分为四个区 (1)T-DNAE(transferred-DNA regions) TDNA是农杆菌侵染植物细胞时,从T质粒上切割下来转移 到植物细胞的一段DNA,称为转移DNA。该DNA片段上的基因 与肿瘤的形成有关 (2)VirX(virulence region 该区段上的基因能激活T-DNA转移,使农杆菌表现出毒性, 故称之为毒区。T-DNA区与ir区在质粒DNA上彼此相邻,约占 T质粒DNA的三分之 (3)ConX(regions encoding conjugations 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因(ta),调控 T质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活ta基因,诱导质 粒转移,因此称之为接合转移编码区 (4)Orix (origin of replication 该区段基因调控T质粒的自我复制,故称之为复制起始区
2. Ti质粒的功能区域 Ti质粒可分为四个区。 （1）T-DNA区（transferred-DNA regions）： T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移 到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因 与肿瘤的形成有关。 （2）Vir区（virulence region） 该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性， 故称之为毒区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占 Ti质粒DNA的三分之一。 （3）Con区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控 Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质 粒转移，因此称之为接合转移编码区。 （4）Ori区（origin of replication） 该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区
3.T质粒的生物学功能 ◆T质粒的功能可归为以下7个方面 ①参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸(IA)和 些细胞分裂素的活动。 ②诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态 学特征和冠瘿碱成分 ③赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的 能力 ④赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应 性。 ⑤为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力 ⑥决定寄主菌株的植物寄主范围。 ⑦有的T质粒能够抑制某些根瘤土壤杄菌噬菌体生 长与发育,即具有对噬菌体的“排外性
3. Ti质粒的生物学功能 Ti质粒的功能可归为以下7个方面: ① 参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一 些细胞分裂素的活动。 ② 诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态 学特征和冠瘿碱成分。 ③ 赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的 能力。 ④ 赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应 性。 ⑤ 为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力。 ⑥ 决定寄主菌株的植物寄主范围。 ⑦ 有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体生 长与发育，即具有对噬菌体的“排外性”
二、T-DNA的基因结构与功能 1T-DNA的发现 chilton等人(1982)利用同位素标记的T质粒做 探针发现,加入高浓度烟草肿瘤细胞的DNA后,T质粒 DNA的复性速度有加快的趋势。这表明肿瘤DNA中有T 质粒的顺序,但该顺序不多,而且没有检测到完整的Ti 质粒。以后这些作者将章鱼碱型的T质粒B6806用内切 酶SmaI分解成19个片段,分别用同位素标记做成探针 然后与肿瘤DNA进行分子杂交,结果有二段T质粒的 DNA(3b和10c。)能和肿瘤DNA杂交,也就是百质粒 中这两段DNA是与肿瘤DNA同源的部分。进一步研究证 明,这部分DNA是从质粒DNA上切割后,转移到肿瘤细 胞,故称之为转移DNA( transferred-DNA)。这是首次 证明在高等植物的细胞内存在有微生物的DNA顺序
二、T-DNA的基因结构与功能 1.T-DNA的发现 Chilton等人（1982）利用同位素标记的Ti质粒做 探针发现，加入高浓度烟草肿瘤细胞的DNA后，Ti质粒 DNA的复性速度有加快的趋势。这表明肿瘤DNA中有Ti 质粒的顺序，但该顺序不多，而且没有检测到完整的Ti 质粒。以后这些作者将章鱼碱型的Ti质粒B6 -806用内切 酶Sma I分解成19个片段，分别用同位素标记做成探针， 然后与肿瘤DNA进行分子杂交，结果有二段Ti质粒的 DNA（3b和10c。）能和肿瘤DNA杂交，也就是Ti质粒 中这两段DNA是与肿瘤DNA同源的部分。进一步研究证 明，这部分DNA是从质粒DNA上切割后，转移到肿瘤细 胞，故称之为转移DNA（transferred-DNA）。这是首次 证明在高等植物的细胞内存在有微生物的DNA顺序
2.T-DNA的结构特 ◆质粒T-DNA区的长度约为23kb ◆TDNA仅存在于植物肿瘤细胞的核DNA中;TDNA含有激发和 保持肿瘤状态所必需的基因;TDNA和植物DNA之间没有同源 ◆。在DNA的5端和3端都有真核表达信号。如T下Abx AATAAboX及poyA等 ◆TDNA的两端左右边界各为25b的重复序列,即边界序列 ( border sequence),分别称之为左边界(BL或T)和右边界 (BR或TR)。(图8-4)。该25bp边界序列属保守序列但通常右边 界(TR)序列更为保守,左边界(TL)序列在某些情况下有所变化。 其核心部分是14bp,可分为10 bp(cacgatatat)及4bp(GTA)两部 分,是完全保守的 ◆左边界(TL)缺失突变仍能致瘤,但右边界(TR)缺失则不再能 致瘤,这里几乎完全没有TDNA的转移,这说明右边界(TR)在TDNA 转移中的重要性
2.T-DNA的结构特点 l Ti质粒T-DNA区的长度约为23kb l T-DNA仅存在于植物肿瘤细胞的核DNA中；T-DNA含有激发和 保持肿瘤状态所必需的基因；T-DNA和植物DNA之间没有同源 l 在T-DNA的5´端和3´端都有真核表达信号。如TATAbox、 AATAAbox及polyA等。 l T-DNA的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序列 （border sequence），分别称之为左边界（BL或TL）和右边界 （BR或TR）。(图8-4)。该25bp边界序列属保守序列,但通常右边 界（TR）序列更为保守，左边界(TL)序列在某些情况下有所变化。 其核心部分是14bp，可分为10bp(CACGATATAT)及4bp(GTAA)两部 分,是完全保守的。 左边界（TL）缺失突变仍能致瘤,但右边界（TR）缺失则不再能 致瘤,这里几乎完全没有T-DNA的转移,这说明右边界(TR)在T-DNA 转移中的重要性
3.T-DNA上的编码基因及功能 ◆TDNA的转录有下述共同点: ①TDNA的两条链都是有意义链,即都能被转录 ②TDNA上每个基因都有各自的启动子 ③基因的转录由植物细胞RNA聚合酶Ⅱ完成。 ④TDNA具典型的真核生物RNA合成起始和终止的调节信 号,在其5端转录起始处有TATA和CAAT盒。同时 AATAAA加尾信号也在同一条链上发现,故T-DNA的转 录机理可能与真核生物相同。 ⑤植物或农杄菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活 性
3. T-DNA上的编码基因及功能 T-DNA的转录有下述共同点： ①T-DNA的两条链都是有意义链,即都能被转录。 ②T-DNA上每个基因都有各自的启动子。 ③基因的转录由植物细胞RNA聚合酶Ⅱ完成。 ④T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和终止的调节信 号，在其5’ 端转录起始 处有 TATA和CAAT 盒。同 时 AATAAA加尾信号也在同一条链上发现，故T-DNA的转 录机理可能与真核生物相同。 ⑤植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活 性