含区5淫紐论》 第一章导论 第二章基因操作的工具酶 第三章基因克隆的载体 第四章基因克隆的策略 第五章克隆基因的表达 第六章基因工程的基本技术
《基因工程概论》 第一章 导 论 第二章 基因操作的工具酶 第三章 基因克隆的载体 第四章 基因克隆的策略 第五章 克隆基因的表达 第六章 基因工程的基本技术
第四章基因克隆的策略 引言 第一节目的基因的获得 第二节重组体的构建及细菌转化 第三节重组克隆的筛选和鉴定
第四章 基因克隆的策略 引 言 第一节 目的基因的获得 第二节 重组体的构建及细菌转化 第三节 重组克隆的筛选和鉴定
引言 基因克隆的本质是把某一目标DNA片段通过无性 的方式进行扩增和表达,而这一过程往往是通过载体 和寄主细胞来实现的。 般而言,基因克隆包括四部分工作:1、目标 DNA片段的获得;2、克隆载体的构建;3、寄主细胞 的转化;4、重组体克隆的选择和鉴定。 目前,以大肠杆菌为寄主,以质粒和噬菌体等为 载体的基因克隆体系已经相当的成熟,本章将以这种 克隆模式为主体对基因克隆的策略展开讨论和分析
引 言 基因克隆的本质是把某一目标DNA片段通过无性 的方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体 和寄主细胞来实现的。 一般而言，基因克隆包括四部分工作：1、目标 DNA片段的获得；2、克隆载体的构建；3、寄主细胞 的转化；4、重组体克隆的选择和鉴定。 目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为 载体的基因克隆体系已经相当的成熟，本章将以这种 克隆模式为主体对基因克隆的策略展开讨论和分析
大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实骀方豪 NA片段限制性内 双链DNA 化学法 的获得 切酶消化 机械切割 的合成 直接合成 载体构建 同聚物 粘性末端 平末端 加接头造成 加尾 连接 连接 粘性末端 细菌转化重组噬菌体重组质粒 体外包装 DNA转染 的转化 进行转导 ●●●●●● ●●●●●●● 重组体 的鉴定:表型鉴定 核酸杂交 免疫学分析酶切鉴定·
大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案 DNA片段 的获得 载体构建 细菌转化 重组体 的鉴定 限制性内 切酶消化 机械切割 双链cDNA 的合成 化学法 直接合成 同聚物 加尾 粘性末端 连接 平末端 连接 加接头造成 粘性末端 重组噬菌体 DNA转染 重组质粒 的转化 体外包装 进行转导 表型鉴定 核酸杂交 免疫学分析 酶切鉴定
第四章基因克隆的策略 引言 第一节目的基因的获得 第二节重组体的构建及细菌转化 第三节重组克隆的筛选和鉴定
第四章 基因克隆的策略 引 言 第一节 目的基因的获得 第二节 重组体的构建及细菌转化 第三节 重组克隆的筛选和鉴定
第一节目的DNA片段的获得 1、化学法直接合成基因 2、从基因组文库中钓取目的基因 3、从cDNA文库中钓取目的基因 4、通过PCR直接扩增出目的基因
第一节 目的DNA片段的获得 1、化学法直接合成基因 2、从基因组文库中钓取目的基因 3、从cDNA文库中钓取目的基因 4、通过PCR直接扩增出目的基因
1、化学法直接合成基因 所谓基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列,所以 只要掌握了其分子结构,完全可以在实验室进行人工合成。 1977年,K. Itakura利用化学途径首次合成了编码脑激素的 基因(〔生长激素释放因子基因),并在大肠杆菌中实现了成功的 表达。从此,化学合成基因得到了很大的发展迅速 早期通过化学合成的部分基因 基因 大小(bp)合成年代基因 大小(bp)合成年代 1057 人胰岛素126 1978 视紫红质77 1985 转运RNA542 1979 前脑菲肽170 1985 α-干扰素81 1981 ATP酶 385 1985 肠促胰液肽162 1982 溶菌酶 324 1985 尿抑胃激素453 1982 RNA酶T1375 1986 y-千扰素 1984 RNA酶A 1987
1、化学法直接合成基因 所谓基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列，所以 只要掌握了其分子结构，完全可以在实验室进行人工合成。 1977年，K. Itakura利用化学途径首次合成了编码脑激素的 基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的 表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。 早期通过化学合成的部分基因 基因 人胰岛素 转运RNA -干扰素 肠促胰液肽 尿抑胃激素 -干扰素 大小（bp） 126 542 81 162 453 合成年代 1978 1979 1981 1982 1982 1984 基因 视紫红质 前脑菲肽 ATP酶 溶菌酶 RNA酶T1 RNA酶Ａ 大小（bp） 1057 77 170 385 324 375 合成年代 1985 1985 1985 1985 1986 1987
1、化学法直接合成基因 磷酸二酯法寡核苷酸片段的合成 首先,将一个5端保护了的核苷酸和另一个3端保护了的核苷 酸通过缩合反应形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。 为了定向形成5′3磷酸二酯键,通常用化学物质将不参加反应的 基团保护起来。 Deoxy-ATP Deoxy-GTP Guanine (deoxyadenosine Adenine (deoxyguanosine triphosphate) NH biphosphate p h H Phosphate groups H2N O-P-0-P-0-P-0-cH2O o一P-0-P-0-P-0—cH2O H HH H H Deoxy ribose HO H sugar HO H
磷酸二酯法寡核苷酸片段的合成 首先，将一个5′端保护了的核苷酸和另一个3 ′端保护了的核苷 酸通过缩合反应形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。 为了定向形成5 ′- 3 ′磷酸二酯键，通常用化学物质将不参加反应的 基团保护起来。 1、化学法直接合成基因
反应结束后可以通过酸或碱的脱保护作用将保护基团去掉, 这样一个5‘保护了的合成的二核苷酸分子就又能和一个3端保护 了的单核苷酸分子进行第二次缩合反应形成一个三核苷酸的分子。 如此反复进行缩合反应,就可以合成一条特定的寡核苷酸片段。 Thymine (T) ".H- Adenine(A) AS Cytosine(c) … Guanine(G) A G Hydrogen bond
反应结束后可以通过酸或碱的脱保护作用将保护基团去掉， 这样一个5 ′保护了的合成的二核苷酸分子就又能和一个3 ′端保护 了的单核苷酸分子进行第二次缩合反应形成一个三核苷酸的分子。 如此反复进行缩合反应，就可以合成一条特定的寡核苷酸片段
1、化学法直接合成基因 基因的组装过程 通过化学合成的寡接首酸片最只危达到50-200b的长度, 而一个基因的长度通常要大的多。所以必须通过一定的程序将 寡核苷酸片段连接起来构建成一个完整的基因。这种将多个寡 核苷酸片段装配成完整基因的过程称为基因的组装 基因组装常用的有两种方法:一种方法是先将寡核苷酸 片段激活,带上5磷酸基团,然后与相应的互补寡核苷酸片段 退火形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段,最后通过连接酶 将这些寡核苷酸片段逐个连接起来成为完整的基因。第二种 方法是将两条具有3端互补的寡核苷酸单链进行退火,所产生 的单链区段可在 Klenow酶的聚合作用下很快得到互补的延伸, 这样就可以得到一段连接好的双链寡核苷酸片段,以此类推便 可得到合成的基因片段
基因的组装过程 通过化学合成的寡核苷酸片段只能达到150-200bp的长度， 而一个基因的长度通常要大的多。所以必须通过一定的程序将 寡核苷酸片段连接起来构建成一个完整的基因。这种将多个寡 核苷酸片段装配成完整基因的过程称为基因的组装。 基因组装常用的有两种方法：一种方法是先将寡核苷酸 片段激活，带上5′磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段 退火形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，最后通过连接酶 将这些寡核苷酸片段逐个连接起来成为完整的基因。第二种 方法是将两条具有3 ′端互补的寡核苷酸单链进行退火，所产生 的单链区段可在Klenow酶的聚合作用下很快得到互补的延伸， 这样就可以得到一段连接好的双链寡核苷酸片段，以此类推便 可得到合成的基因片段。 1、化学法直接合成基因