在人和动物周血中，存在形态不同功能各的多种血细。它们是红细陶、拉细胞、单核细跑、热巴细及血小板。其生命亦各不 同，如人红细胞生命周期约120天，粒细约20一62小时，血小板约为510天，单核细存在于 50天，存在于周国血者可超过20 胞的动态平衡异常。 可使血 和质量发生改变，将会引店 ,即造血干细 第一节造血干细胞的特性 一造血干细胞的起源 造血干细胞(hemopoietic stemcll,HSC)是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，它不是组织固定细胞，可存在于造血组织及血液 中，造血干细抱在人胚胎2周时可出现于卵黄囊，第4周开始转移至胚肝，好娠3个月后，骨髓开始造血，出生后骨髓成为干细胞的主要来源。 在选血组织中，所占比例甚少，如在小鼠母髓中105核细胞中的有10个，在脚中103有核细跑中只有0.2个， 二、造血干细胞的形态 干细胞是一种嗜碱性独核细胞，其大小约为8仙m,呈图形，胞核为圈形或肾形，胞核校大，具有2个核仁，染色质细质而分散，抱浆呈浅蓝 色不带颗粒，在形态上与小淋巴细胞极其相似，但淋巴细胞体积较小，染色质浓染，核仁不明显且有细跑器。因此很难用形态学识别干细胞， 井与其它独核细抱相区别。 造血干细陶可包括三级分化水平，即多能干细跑(pleuripotent stem cell),定向干细跑(Committed stem cell)及其成熟的子代细 关于对造血干细胞的功能分析，长期以来仅限于对小鼠干细胞的研究，而对人干细胞的存在只是来自间接证据，因为不能在人体内进行如 鼠体内的功能分析法，0年代以来，由于建立了新的体外细胞培养技术，大大促进了对人干细胞的直接研究 三、造血干细胞的表面标志 究由清血组民中造血干国脂在形态学方面无法与黄它单喷区到。而藏量少，这为造血干的分调院化井对汽功能分行和分化@ 大困难 术的进 ,流式细抱仪(CS)的应用，以及对小和人选血干细胞表面标志的研究 取得了很大进展，为选 了条件 (heae多rmg8 lutinin,.WGA)Visseer等发现小鼠骨随中造血干细胞对WGA有高亲和性. 利用这 特性，应用FAC 即可自骨髓中Lm-WGA+细泡群中分离造血干细胞也获得良好结 也有学者发现正常小鼠骨随细胞中，也能表达低密度Ty1抗原(Ty山， 上述标志组合，即自骨髓Thy-1,Lin,WGA+细胞群 中，分离造血干细组 可用于对透血细胞的功能分析 干细胞抗原(stemcellantigen-1,Sca)有学者制备一种抗原前T细胞杂交的单克隆抗体，用这种单抗检出的抗原分子称为干细抗 原-1(Sca-l） ,其后有人自骨中Thy-1o、Ln-,Sca1+细胞群中，可分离纯人造血干细 基因(ck)最近证明造血干细跑与ckt基因密切相关.。Ck可编码一种穿膜酪氨酸激砖受体分子。 应用单克降抗体证明此分子 可存在于造血干细购膜上，其后证明它的配体分子是造血干细孢因子((stem cell facor,SCF)·它是信号传导分子，对造血干细胞的分化具有 重要作用。目前，小多能干细跑表面分子标志可视为Ty1Io、WGA+、c-ki+,Lin cki分子可高频率表达于多能干细抱表面，但骨髓中cki+细抱可分化为各种血细胞，而陶腺中ck细胞可分化为淋巴细，不能分化为随 系细胞，所以胸腺内ck+细泡，可能是淋巴样干细胞（表71）， 表7-1鞠腺及骨髓中ckt+细胞分化机制 4.CD34对人体适血干细抱表面标志的研究，是用单克隆抗体CD34证明的。CD34单克隆抗体检测的抗原即为CD34分子.自人骨髓细胞 中应用FACS可分离纯化CD34+细泡群，如与造血因子共同体外培养可获得含有各种血细胞的混合集落，所以CD34+细跑为骨髓中造血干细 跑，CD34抗原可视为骨髓造血细孢标志之一， 第二节造血干细胞的分化 一、多能干细胞 多能干细孢是由T和MeCulloch等在60年代初，应用牌集落形成细孢定量法，首先在小息体内证明的.他们给经射线照射的小鼠输入同系 鼠骨髓细胞，在10一14天后在脾内形成可见的 节，它 是由单一 骨酷细胞发育分化 成的细跑集幕，称之为脾集落形成单位(
在人和动物周围血中，存在形态不同、功能各异的多种血细胞。它们是红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞及血小板。其生命亦各不 同，如人红细胞生命周期约120天，粒细胞约20～62小时，血小板约为5～10天，单核细胞存在于骨髓者约为50天，存在于周围血者可超过200 天，而淋巴细胞可存活数月至数年。这些血细胞可不断死亡与新生以维持血细胞的动态平衡异常，可使血细胞数量和质量发生改变，将会引起 名种血液病或免疫性疾病。各种血细胞都起源于共同的祖先细胞，即造血干细胞。 第一节 造血干细胞的特性 一、造血干细胞的起源 造血干细胞（hemopoietic stem cell,HSC）是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，它不是组织固定细胞，可存在于造血组织及血液 中。造血干细胞在人胚胎2周时可出现于卵黄囊，第4周开始转移至胚肝，妊娠5个月后，骨髓开始造血，出生后骨髓成为干细胞的主要来源。 在造血组织中，所占比例甚少，如在小鼠骨髓中105核细胞中的有10个，在脾中105有核细胞中只有0.2个。 二、造血干细胞的形态 干细胞是一种嗜碱性独核细胞，其大小约为8μm，呈圆形，胞核为圆形或肾形，胞核较大，具有2个核仁，染色质细质而分散，胞浆呈浅蓝 色不带颗粒，在形态上与小淋巴细胞极其相似，但淋巴细胞体积较小，染色质浓染，核仁不明显且有细胞器。因此很难用形态学识别干细胞， 并与其它独核细胞相区别。 造血干细胞可包括三级分化水平，即多能干细胞（pleuripotent stem cell），定向干细胞（Committed stem cell）及其成熟的子代细 胞。 关于对造血干细胞的功能分析，长期以来仅限于对小鼠干细胞的研究，而对人干细胞的存在只是来自间接证据，因为不能在人体内进行如 鼠体内的功能分析法。70年代以来，由于建立了新的体外细胞培养技术，大大促进了对人干细胞的直接研究。 三、造血干细胞的表面标志 由于造血组织中造血干细胞在形态学方面无法与其它单核细胞区别，而且数量极少，这为造血干细胞的分离纯化并对其功能分析和分化的 研究造成极大困难。 近年来由于单克隆抗体技术的进步，流式细胞仪（FACS）的应用，以及对小鼠和人造血干细胞表面标志的研究，取得了很大进展，为造血 细胞的分离纯化及鉴定创造了条件。 1．Thy-1与丝裂原（wheat germ agglutinin,WGA）Visseer等发现小鼠骨髓中造血干细胞对WGA有高亲和性。利用这一特性，应用FACS 自骨髓中分离造血干细胞应及核系Mac-1等谱系抗原与WGA反应性相结合，即可自骨髓中Lin-/WGA+细胞群中分离造血干细胞，也获得良好结 果。 也有学者发现正常小鼠骨髓细胞中，也能表达低密度Thy-1抗原（Thy-11。）。如与上述标志组合，即自骨髓Thy-11。Lin-,WGA+细胞群 中，分离造血干细胞，可用于对造血细胞的功能分析。 2．干细胞抗原（stemcellantigen-1,Sca-1） 有学者制备一种抗原前T细胞杂交瘤的单克隆抗体，用这种单抗检出的抗原分子称为干细胞抗 原-1（Sca-1）。其后有人自骨髓中Thy-1Io、Lin-、Sca-1+细胞群中，可分离纯人造血干细胞。 3．原癌基因（c-kit） 最近证明造血干细胞与c-kit基因密切相关。C-kit可编码一种穿膜酪氨酸激酶受体分子。应用单克隆抗体证明此分子 可存在于造血干细胞膜上，其后证明它的配体分子是造血干细胞因子（stem cell factor,SCF）。它是信号传导分子，对造血干细胞的分化具有 重要作用。目前，小鼠多能干细胞表面分子标志可视为Thy-1Io、WGA+、c-kit+、Lin-。 c-kit分子可高频率表达于多能干细胞表面,但骨髓中c-kit+细胞可分化为各种血细胞，而胸腺中c-kit细胞可分化为淋巴细胞，不能分化为髓 系细胞，所以胸腺内c-kit+细胞，可能是淋巴样干细胞（表7-1）。 表7-1 胸腺及骨髓中c-kit+细胞分化机制 胸腺c-kit 骨髓c-kit 粒细胞系 － + 单核细胞系 － + 红细胞系 － + T细胞 + + B细胞 + + 4．CD34 对人体造血干细胞表面标志的研究，是用单克隆抗体CD34证明的。CD34单克隆抗体检测的抗原即为CD34分子。自人骨髓细胞 中应用FACS可分离纯化CD34+细胞群，如与造血因子共同体外培养可获得含有各种血细胞的混合集落，所以CD34+细胞为骨髓中造血干细 胞，CD34抗原可视为骨髓造血细胞标志之一。 第二节 造血干细胞的分化 一、多能干细胞 多能干细胞是由Till和McCulloch等在60年代初，应用脾集落形成细胞定量法，首先在小鼠体内证明的。他们给经射线照射的小鼠输入同系 鼠骨髓细胞，在10～14天后在脾内形成可见的结节，它是由单一骨髓细胞发育分化而成的细胞集落，称之为脾集落形成单位（colony forming
unit-speen,CFU-S),集落数与输入的细胞数成正比，它可分化发育为红细胞、粒细胞及巨核细抱。CFU-S长期以来用体内集落法进行检测， 在70年代后Johnson和etcalf等应用鼠胎肝细抱体外培养法，证明具有CFUS性质的干细抱可在体外培养成功，这是在研究干细胞方法学 上的重大改进. 其后，Haral等用小鼠骨菌细胞在甲基纤维素中加入红细陶生成素(erythropon,EPO)及脾细胞培养上清，进行体外培养，可形成含有 红细胞.巨核细胞以及巨磁细胞的集落，称为混合集幕形成单位(CFU-Mix)·其后，小林登等在8O年代用人骨髓细跑亦报告CFU-Mx培养成 功。即由多能干细胞可进一步分化为定向髓系多能干细鸭及淋巴系干细胞。淋巴系干细胞是T和B细胞的共同相先细胞，但目前尚不能用脾集落 实验证明其存在， 二、单能干细胞 单能干细胞是一类具有向特定细胞系分化能力的干细胞，也称为相细弛(pr0 genitor),如进行体内移植不能形成脾集落，但在一定造血因 子的存在下，可在体外培养并形成细胞集落，称为代表外培养集落，称为体外培养集落形成单位(colony forming unit-culture,CFUC),因此 它与多能干细胞不同，它可包括分化为红细胞的红系干细胞，可分化为粒细胞和单核细胞的粒、单核细胞干细胞系及可分化为血小板的巨核干 细陶系 1.红系干细胞应用骨髓细跑加甲基纤维素在大量EPO存在下，进行体外培养可产生大型红细跑集落，可含有1000个以上的细胞，形成如 爆发火花样的售落，称此干细胞为爆式红细胞集落形成细跑(rs it-erythoid,BFU-E),如用小剂量EPO则产生小型集落，由8-50个细胞 组成，称此干细胞为红细孢系集落形成细胞(colony forming unit-.E,CFU-E)BFU-E是更早期的红系干细胞，而CFU-E则为较晚期的红系干细 胞 2。粒细胞单核细胞系干细胞此系细跑在功能上与BFUE或CFUE属同级干细胞。应用软琼脂法将骨髓细跑进行体外培养，在集落利激因 子(CFS)存在下，可产生粒细跑和单核细胞集落，称此集落形成细胞为体外培养集落形成细胞(colony formingunti,culture,.CFU.C)将 CFU.C进行体内移植不能产生牌集落，所以CFU.D不有CFU.S的特性，仅具有前驱细跑和前单核细跑的特征. 3.巨核干细胞系亦称巨核细胞集落形成细胞(colonyformin 0Cvte,CFU一M,Metcalf及其分泌的细胞因子和细胞外基质 (extra-cellular matrix,ECM)组成，因此对造血干细孢发育分化过程的体外研究，有很大同限性，它不一定能真实反映体内情况，分析实验结 果时，必须注意这种局限性。目前仍有很多关于造血干细胞发育分化的问题有待阐明， 表72血细跑的分化与成熟 多能定干纽 的定向干组 成子代细的 红细 髓系干细胞 跑/单核细胞 多能干细韵 淋巴系干细胞 前驱T细胞 T细跑 十@ 一@t a 图71造血干细狗分化与造血因子 第三节造血干细胞与淋巴细胞的发生 直到60年代W等建立了放射诱导染色体标记技术
unit-spleen,CFU-S）。集落数与输入的细胞数成正比，它可分化发育为红细胞、粒细胞及巨核细胞。CFU-S长期以来用体内集落法进行检测。 在70年代后Johnson和Metcalf等应用鼠胎肝细胞体外培养法，证明具有CFU-S性质的干细胞可在体外培养成功，这是在研究干细胞方法学 上的重大改进。 其后，Haral等用小鼠骨髓细胞在甲基纤维素中加入红细胞生成素（erythropoietin,EPO）及脾细胞培养上清，进行体外培养，可形成含有 红细胞、巨核细胞以及巨噬细胞的集落，称为混合集落形成单位（CFU-Mix）。其后，小林登等在80年代用人骨髓细胞亦报告CFU-Mix培养成 功。即由多能干细胞可进一步分化为定向髓系多能干细胞及淋巴系干细胞。淋巴系干细胞是T和B细胞的共同祖先细胞，但目前尚不能用脾集落 实验证明其存在。 二、单能干细胞 单能干细胞是一类具有向特定细胞系分化能力的干细胞，也称为祖细胞（progenitor）。如进行体内移植不能形成脾集落，但在一定造血因 子的存在下，可在体外培养并形成细胞集落，称为代表外培养集落，称为体外培养集落形成单位（colony forming unit-culture,CFU-C），因此 它与多能干细胞不同，它可包括分化为红细胞的红系干细胞，可分化为粒细胞和单核细胞的粒、单核细胞干细胞系及可分化为血小板的巨核干 细胞系。 1．红系干细胞应用骨髓细胞加甲基纤维素在大量EPO存在下，进行体外培养可产生大型红细胞集落，可含有1000个以上的细胞，形成如 爆发火花样的集落，称此干细胞为爆式红细胞集落形成细胞（burstunit-erythoid ,BFU-E）。如用小剂量EPO则产生小型集落，由8～50个细胞 组成，称此干细胞为红细胞系集落形成细胞（colony forming unit-E,CFU-E）BFU-E是更早期的红系干细胞，而CFU-E则为较晚期的红系干细 胞。 2．粒细胞-单核细胞系干细胞 此系细胞在功能上与BFU-E或CFU-E属同级干细胞。应用软琼脂法将骨髓细胞进行体外培养，在集落刺激因 子（CFS）存在下，可产生粒细胞和单核细胞集落，称此集落形成细胞为体外培养集落形成细胞（colonyformingunti-culture,CFU-C）。将 CFU-C进行体内移植不能产生脾集落，所以CFU-D不具有CFU-S的特性，仅具有前驱细胞和前驱单核细胞的特征。 3．巨核干细胞系亦称巨核细胞集落形成细胞（colonyforming unti-megakaryocyte,CFU-M），Metcalf及其分泌的细胞因子和细胞外基质 （extra-cellular matrix,ECM）组成，因此对造血干细胞发育分化过程的体外研究，有很大局限性，它不一定能真实反映体内情况，分析实验结 果时，必须注意这种局限性。目前仍有很多关于造血干细胞发育分化的问题有待阐明。 表7-2 血细胞的分化与成熟 多能干细胞 多能定向干细胞 单能定向干细胞 成熟子代细胞 髓系干细胞 红系干细胞 粒、单核系干细胞 巨核干细胞 红细胞 粒细胞/单核细胞 血小板 淋巴系干细胞 前驱B细胞 前驱T细胞 B细胞 T细胞 图7－1 造血干细胞分化与造血因子 第三节 造血干细胞与淋巴细胞的发生 由于用脾集落法未能证明淋巴细胞的发生，所以造血干细胞与淋巴细胞在发生学的关系，直到60年代Wu等建立了放射诱导染色体标记技术 后才逐步得到阐明
W等用照射诱导小鼠骨髓干细孢染色体发生一定程度的畸变，做为标记，但又不影响其细胞分裂。将这种细胞输入另一照射小鼠体内后， 可以重建其适血和免疫功能。 由于它们具有特殊的畸形染色体，因此在照射宿主体内，任何二种细胞只要它们有共同的标记染体，应表明它们是来自同一干细跑。由于 在照射诱导条件下，骨髓细跑中分化程度不同的干细跑，可以产生不同类型的染色体畸变，所以通过核型分析就能检查不同细胞的共同前体细 胞. Abramon等在70年代，用上述方法，发现在受体小鼠骨萄细胞、脾集落形成细胞以及经植物血凝素(PH)和脂多糖(LPS)等丝裂原刺 激的体外培养碑细胞中，都发现了一种共同的标记染色体，这证明它们都是从供体骨髓中的多能干细胞分化而来，从而有力的证明了无论是髓 系干细胞和淋巴细胞，都是来自共同的造血干细胞， 目前已证明在小鼠骨糙中存在有前驱T细胞(proT)和前驱B细胞(pr0-B)。PoT进入胸象后可发育分化为成熟T细胞，pr0-B则在骨髓内 发育分化为成熟B细跑。但尚未直接证明在小鼠骨酷中存在有淋巴系干细胞。虽然如此，多数学者认为淋巴系干细孢可能是存在的。其检测困 难可能是由于数量太少，或是由于对照射过于敏感，在照射过程中被选择地排除了， 近年的实验证明。在小鼠骨萄中®kt+细胞可分化为各种血细胞及T和B细胞，但如将胸象内c-k+细胞移植于小鼠体内，则丧失其分化为随 系细鸭的能力，仍能分化为T和B细胞，提示这种胸腺ck细胞可能是淋巴系干细胸
Wu等用照射诱导小鼠骨髓干细胞染色体发生一定程度的畸变，做为标记，但又不影响其细胞分裂。将这种细胞输入另一照射小鼠体内后， 可以重建其造血和免疫功能。 由于它们具有特殊的畸形染色体，因此在照射宿主体内，任何二种细胞只要它们有共同的标记染体，应表明它们是来自同一干细胞。由于 在照射诱导条件下，骨髓细胞中分化程度不同的干细胞，可以产生不同类型的染色体畸变，所以通过核型分析就能检查不同细胞的共同前体细 胞。 Abramon等在70年代，用上述方法，发现在受体小鼠骨髓细胞、脾集落形成细胞以及经植物血凝素（PHA）和脂多糖（LPS）等丝裂原刺 激的体外培养脾细胞中，都发现了一种共同的标记染色体，这证明它们都是从供体骨髓中的多能干细胞分化而来，从而有力的证明了无论是髓 系干细胞和淋巴细胞，都是来自共同的造血干细胞。 目前已证明在小鼠骨髓中存在有前驱T细胞（pro-T）和前驱B细胞（pro-B）。ProT进入胸腺后可发育分化为成熟T细胞，pro-B则在骨髓内 发育分化为成熟B细胞。但尚未直接证明在小鼠骨髓中存在有淋巴系干细胞。虽然如此，多数学者认为淋巴系干细胞可能是存在的。其检测困 难可能是由于数量太少，或是由于对照射过于敏感，在照射过程中被选择地排除了。 近年的实验证明。在小鼠骨髓中c-kit+细胞可分化为各种血细胞及T和B细胞，但如将胸腺内c-kit+细胞移植于小鼠体内，则丧失其分化为髓 系细胞的能力，仍能分化为T和B细胞。提示这种胸腺c-kit细胞可能是淋巴系干细胞