第十三单元 (综合型实验)
第十三单元 （综合型实验）
实验一 酶联免疫吸附实验检测 伤寒O抗体方法的建立 (综合性实验)
实验一 酶联免疫吸附实验检测 伤寒O抗体方法的建立 （综合性实验）
实验原理 检测伤寒O抗体在伤寒菌感染的诊断中具有重要意 义，采用肥达反应可对抗体进行半定量检测；若采用 新一代的免疫检测技术建立对伤寒O抗体准确定量检测 的法，则可提高临床诊断效果。以伤寒0抗原免疫动物， 制备出抗伤寒O的抗体，将后者纯化抗体与酶连接制备 成酶标抗体；以伤寒0抗原包被酶标板，制备伤寒酶标 抗体为竞争抗体，以竞争法检测伤寒抗体酶联免疫检 技术
实验原理 检测伤寒O抗体在伤寒菌感染的诊断中具有重要意 义，采用肥达反应可对抗体进行半定量检测；若采用 新一代的免疫检测技术建立对伤寒O抗体准确定量检测 的法，则可提高临床诊断效果。以伤寒O抗原免疫动物， 制备出抗伤寒O的抗体，将后者纯化抗体与酶连接制备 成酶标抗体;以伤寒O抗原包被酶标板，制备伤寒酶标 抗体为竞争抗体，以竞争法检测伤寒抗体酶联免疫检 技术
实验材料 1.伤寒沙门菌菌体“0”抗原（免疫用) 2.伤寒沙门菌可溶性菌体“0”抗原（包备用) 3.饱和硫酸铵溶液 4. 酶标用洗涤液 5.酶标用稀释液 6.酶标用底物液 7.酶标用终止液(2mol/LH2S04) 8.伤寒“O”抗原包被酶标板 9.待检血清标本 10.实验室标准阳性血清 11.ELISA读数仪
1. 伤寒沙门菌菌体“O”抗原（免疫用） 2. 伤寒沙门菌可溶性菌体“O”抗原（包备用） 3. 饱和硫酸铵溶液 4. 酶标用洗涤液 5. 酶标用稀释液 6. 酶标用底物液 7. 酶标用终止液 (2mol/L H2SO4 ) 8. 伤寒“O”抗原包被酶标板 9. 待检血清标本 10.实验室标准阳性血清 11.ELISA读数仪 实验材料
实验流程 制备抗伤寒O抗体和O抗原 抗体纯化 酶(HRP)标记抗体 竞净ELISA检测伤寒O抗体条件的优化 标准曲线确定 标本检测与结果判断
制备抗伤寒O抗体和O抗原 抗体纯化 酶(HRP)标记抗体 竞争ELISA检测伤寒O抗体条件的优化 标准曲线确定 标本检测与结果判断 实验流程
实验方法 伤寒沙门菌菌体“O”抗原（免疫用） 取伤寒沙门菌标准菌株（伤寒沙门菌O901)的典型光 滑型菌落，密集划线接种于普通琼脂平板，37℃培养24h, 用无菌生理盐水洗下菌苔，移入无菌的三角烧瓶中。充分 振摇，置100℃水浴1h,杀菌及破坏H抗原。菌悬液离心， 4000r/min,10min,弃上清。菌体再用无菌生理盐水洗涤， 弃上清。无活菌试验合格后，用无菌生理盐水稀释成8~10 亿/ml,即成伤寒沙门菌"O菌体抗原
取伤寒沙门菌标准菌株（伤寒沙门菌O901）的典型光 滑型菌落，密集划线接种于普通琼脂平板，37℃ 培养24h， 用无菌生理盐水洗下菌苔，移入无菌的三角烧瓶中。充分 振摇，置100℃ 水浴1h，杀菌及破坏H抗原。菌悬液离心， 4000r/min，10min，弃上清。菌体再用无菌生理盐水洗涤， 弃上清。无活菌试验合格后，用无菌生理盐水稀释成8~10 亿／ml，即成伤寒沙门菌“O”菌体抗原。 实验方法 ❖伤寒沙门菌菌体“O”抗原（免疫用）
%伤寒沙门菌可溶性菌体“0”抗原（包备用) 取伤寒沙门菌0901接种于普通琼脂平板，37℃培 养24h,用无菌生理盐水洗下菌苔，配成70~100亿/ml菌 悬液，隔水煮沸2h,离心，3500r/min,10min,取上清 即伤寒沙门菌可溶性菌体“O抗原。 表1制备细菌免疫血清的免疫程序 日期 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 抗原剂量(ml) 0.1 0.2 0.3 0.5 1.0 途径 多点皮内 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉
取伤寒沙门菌O901接种于普通琼脂平板，37℃ 培 养24h，用无菌生理盐水洗下菌苔，配成70~100亿/ml菌 悬液，隔水煮沸2h，离心，3500r/min，10min，取上清 即伤寒沙门菌可溶性菌体“O”抗原。 ❖伤寒沙门菌可溶性菌体“O”抗原（包备用） 日期 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 抗原剂量（ml） 0.1 0.2 0.3 0.5 1.0 途径 多点皮内 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉 表1 制备细菌免疫血清的免疫程序
抗体制备 制备抗伤寒0抗体推荐快速免疫方案供参考采用（表 1):取已制备的伤寒沙门氏菌体0抗原（10亿/ml), 免疫程序如下表。最后两次注射剂量较大，要缓慢推注。 在末次免疫2天后试血，采用直接凝集法测定效价（见第二 单元)。如凝集效价大于1：1280，则可于一周后放血。效 价过低，可再加强注射。 表1制备细菌免疫血清的免疫程序 日期 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 抗原剂量(ml) 0.1 0.2 0.3 0.5 1.0 途径 多点皮内】 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉
❖ 抗体制备 制备抗伤寒O抗体 推荐快速免疫方案供参考采用（表 1）：取已制备的伤寒沙门氏菌体O抗原（１０亿／ml）， 免疫程序如下表。最后两次注射剂量较大，要缓慢推注。 在末次免疫2天后试血，采用直接凝集法测定效价（见第二 单元）。如凝集效价大于1∶1280，则可于一周后放血。效 价过低，可再加强注射。 日期 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 抗原剂量（ml） 0.1 0.2 0.3 0.5 1.0 途径 多点皮内 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉 表1 制备细菌免疫血清的免疫程序
抗体的纯化与酶标记 1份免疫血清加1份生理盐水，边搅拌边滴加2份饱和硫 酸铵溶液，于4℃静置2h,2000rmin离心20min,吸弃上清 将沉淀溶于适量生理盐水（尽量保持高蛋白浓度)，放置 透析袋中，多次更换生理盐水（透析液），得初步纯化的免疫 抗体。采用改良NaIO4标记法将酶与抗体的连接，其他备选 的标记方法请参考单元一
1份免疫血清加1份生理盐水，边搅拌边滴加2份饱和硫 酸铵溶液，于4℃静置2h，2000r/min离心20 min，吸弃上清， 将沉淀溶于适量生理盐水（尽量保持高蛋白浓度），放置 透析袋中，多次更换生理盐水(透析液)，得初步纯化的免疫 抗体。采用改良NaIO4标记法将酶与抗体的连接，其他备选 的标记方法请参考单元一。 ❖ 抗体的纯化与酶标记
改良NaIO4标记法将酶 1. 取5 mg HRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06 M NaIO4 水溶液0.5ml,混匀，4℃30min; 2.再加入0.16M乙二醇水溶液(10mlH20+0.09ml乙二醇)0.5 ml,室温放置30min。 3.然后加入含5m纯化抗体的水溶液1ml,混匀，并装入透析 袋，于0.05MpH9.5碳酸盐缓冲液中搅拌透析6h(或过夜)， 使之结合； 4.加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml,混匀，4℃2h； 5.最后缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30mi, 离心，去上清，以0.02MpH7.4PBS液溶解沉淀并4℃透析除 盐过夜； 6.次日取出离心，去除沉淀，即得酶抗体（HRP-IgG)结合物， 以0.02MpH7.4PBS液加至5ml
1. 取5 mg HRP溶于0.5 ml双馏水中，加入新配制的0.06 M NaIO4 水溶液0.5 ml，混匀，4 ℃ 30 min； 2. 再加入0.16 M乙二醇水溶液（10 ml H2O+0.09 ml乙二醇）0.5 ml，室温放置30 min。 3. 然后加入含5 mg纯化抗体的水溶液1 ml，混匀，并装入透析 袋，于0.05 M pH 9.5碳酸盐缓冲液中搅拌透析6 h（或过夜）， 使之结合； 4. 加入NaBH4溶液（5 mg/ml）0.2 ml，混匀，4 ℃ 2 h； 5. 最后缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4 ℃ 30 min， 离心，去上清，以0.02 M pH 7.4 PBS液溶解沉淀并4 ℃透析除 盐过夜； 6. 次日取出离心，去除沉淀，即得酶-抗体（HRP-IgG）结合物， 以0.02 M pH 7.4 PBS液加至5 ml。 改良NaIO4标记法将酶