实验四植物叶片活细胞和叶绿 体的分离提取及观察 College of Life Science and Technology,XINJIANG Univercity
实验四 植物叶片活细胞和叶绿 体的分离提取及观察 College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity
实验目的 ● 初步掌握运用机械法分离活细胞和细胞器的 方法； 掌握运用差速离心或密度梯度离心分离纯化 叶肉细胞，细胞核，叶绿体的方法； ·掌握分离的细胞的活性鉴别方法； ●} 熟悉叶肉细胞或原生质体、细胞核、叶绿体 的形态大小
一、实验目的 ⚫ 初步掌握运用机械法分离活细胞和细胞器的 方法； ⚫ 掌握运用差速离心或密度梯度离心分离纯化 叶肉细胞，细胞核，叶绿体的方法； ⚫ 掌握分离的细胞的活性鉴别方法； ⚫ 熟悉叶肉细胞或原生质体、细胞核、叶绿体 的形态大小
二、 实验原理 细胞器的分离是研究细胞器的结构、功能和化学 组成的技术基础，保持分离的细胞器的纯度、结 构完整及其生理、生化活性是本实验的三大要素。 细胞核是植物细胞中最大、最重要的细胞器，使 细胞各种生命活动的指挥中心。叶绿体是植物细 胞进行光合作用，将光能转变成化学能的重要细 胞器。由于它们的重要功能，所以它们一直是细 胞生物学、遗传学、和分子生物学研究的重要对 象。利用离心技术可分离、纯化细胞、细胞核和 叶绿体
二、实验原理 细胞器的分离是研究细胞器的结构、功能和化学 组成的技术基础，保持分离的细胞器的纯度、结 构完整及其生理、生化活性是本实验的三大要素。 细胞核是植物细胞中最大、最重要的细胞器，使 细胞各种生命活动的指挥中心。叶绿体是植物细 胞进行光合作用，将光能转变成化学能的重要细 胞器。由于它们的重要功能，所以它们一直是细 胞生物学、遗传学、和分子生物学研究的重要对 象。利用离心技术可分离、纯化细胞、细胞核和 叶绿体
二、实验原理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离 各种细胞器的常用方法。颗粒在离心场中的沉降速率取决于 颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度 有关。在一给定的离心场中，一定时间内，密度和大小不同 的颗粒其沉降速率不同，依次增加离心力和离心时间，能使 非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心 管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分，最先沉淀的是 细胞，其次是细胞核，接下来是叶绿体。 悬浮介质通常用缓冲的等渗溶液，它与细胞质的分散相 接近，在一定程度上能保持细胞器的真实结构和酶的活性
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离 各种细胞器的常用方法。颗粒在离心场中的沉降速率取决于 颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度 有关。在一给定的离心场中，一定时间内，密度和大小不同 的颗粒其沉降速率不同，依次增加离心力和离心时间，能使 非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心 管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分，最先沉淀的是 细胞，其次是细胞核，接下来是叶绿体。 悬浮介质通常用缓冲的等渗溶液，它与细胞质的分散相 接近，在一定程度上能保持细胞器的真实结构和酶的活性。 二、实验原理
溶酶体 吞噬泡 细胸解 核糖体 细胞膜 细胞膜 液泡 细胞质 糙面内 细胞质 质网 叶绿体 线粒体 核糖体一 线粒体 高尔基体 核纤层 高尔基体 中心体 糙面内 质网 核 核 光面内质网 核孔一 核仁 核孔 核骨架 核纤层 染色体 核膜 核仁 核骨架 核膜 微管 物管 染色体 光面内 质网 微丝 动物细胞结构模式图 植物细胞结构模式图 动物细胞与植物细胞结构模式图
原质体 △ 前质体 照光以黑暗 基质 基粒 基质 类囊体腔 类囊体 基质英 囊体 英囊体 装装 基粒 基质类囊体 叶绿体形成及基粒结构模式图
三、实验用具和试剂 1.仪器：组织捣碎机、高速冷冻离心机、托盘天平、 普通光学显微镜、剪刀、培养皿、250ml烧杯、量 筒、玻璃漏斗、移液管、离心管、滴管、滤纸、 纱布一大块或400目尼龙网、载玻片、盖玻片。 2.试剂：①SNT溶液：0.4W蔗糖、0.01MNaC1 ②0.05 M Tris-HCL缓冲液 日 0.2 M Tris（三羟甲基氨基甲烷) 50ml 0.1N HCL 50-55ml 两液混匀后，加蒸馏水至200ml,pH7.6
三、实验用具和试剂 1．仪器：组织捣碎机、高速冷冻离心机、托盘天平、 普通光学显微镜、剪刀、培养皿、250ml烧杯、量 筒、玻璃漏斗、移液管、离心管、滴管、滤纸、 纱布一大块或400目尼龙网、载玻片、盖玻片。 2．试剂：① SNT溶液：0.4M蔗糖、0.01M NaCl ② 0.05M Tris-HCL缓冲液 ： 0.2M Tris（三羟甲基氨基甲烷） 50ml 0.1N HCL 50-55ml 两液混匀后，加蒸馏水至200ml，pH7.6
三、实验用具和试剂 ③1/3000中性红染液： 称取0.5中性红溶于50 ml Ringer溶液， 稍加热（30~400C)使之很快溶解，用滤纸过 滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀， 失去染色能力。 临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml, 加入29 mI Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。 ④香柏油 3.材料：新鲜菠菜
③ 1/3000中性红染液: 称取0.5中性红溶于50ml Ringer溶液， 稍加热（30~400C）使之很快溶解，用滤纸过 滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀， 失去染色能力。 临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml， 加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。 ④ 香柏油 3．材料：新鲜菠菜 三、实验用具和试剂
四、实验内容 1.组织匀浆液的制备（组织捣碎法)。 2.细胞及细胞器（细胞核、叶绿体等)的分 离、纯化（离心分离法)。 3.细胞、细胞核、叶绿体的镜检（根据形态、 大小、分布位置、数量识别法)。 4.分离细胞活性的鉴别（中性红活体染色 法)
四、实验内容 1．组织匀浆液的制备（组织捣碎法）。 2．细胞及细胞器（细胞核、叶绿体等）的分 离、纯化（离心分离法）。 3．细胞、细胞核、叶绿体的镜检（根据形态、 大小、分布位置、数量识别法）。 4．分离细胞活性的鉴别（中性红活体染色 法）
五、实验方法和步骤 1.取材：取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后，除 叶梗及粗脉，剪成0.5x0.5cm小块。 2.匀浆：将称取60g叶片小块放入组织捣碎机套 筒内，加入200 ml SNT溶液，匀浆20秒（最高 速度)制成匀浆液。 3.过滤：将匀浆液经四层纱布过滤，或400目尼 龙网过滤，滤液分装离心管，平衡
五、实验方法和步骤 1．取材：取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后，除 叶梗及粗脉，剪成0.5x0.5cm小块。 2．匀浆：将称取60g叶片小块放入组织捣碎机套 筒内，加入200ml SNT溶液，匀浆20秒(最高 速度)制成匀浆液。 3．过滤：将匀浆液经四层纱布过滤，或400目尼 龙网过滤，滤液分装离心管，平衡