/NJIANG UNIVERSITY 实验 T淋巴细胞玫瑰花结实验 College of Life Science and Technology,XINJIANG Univercity
实验 十 一 T淋巴细胞玫瑰花结实验 College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity
实验目的 ·1.掌握人淋巴细胞的制备原理和方法及绵 羊红细胞悬液的制备。 2.掌握淋巴细胞玫瑰花结制备方法并了解 该技术在实际工作中的用途。 西 思
一、实验目的 ▪ 1.掌握人淋巴细胞的制备原理和方法及绵 羊红细胞悬液的制备。 ▪ 2.掌握淋巴细胞玫瑰花结制备方法并了解 该技术在实际工作中的用途
二、实验原理 人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体，在体外 定条件下将人淋巴细胞与绵羊红细胞两者混合，可以 形成以T细胞为中心，周围黏附着多个绵羊红细胞的花环， 为E花环试验(erythrocyte rosette test)。应用最广 的有总E花环试验(Et,t为totall的缩写)和活性E花环试 验(Ea,a为active的缩写)。Et代表被检标本中T淋巴细 胞的总数，Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的T细 胞数，这部分T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫 功能和动态变化。 E花环试验主要用于了解机体细胞免疫功能。广泛应 用于肿瘤免疫、移植免疫及免疫性疾病的研究，为某些 疾病诊断和防治提供免疫学方面的重要参考
人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体,在体外 一定条件下将人淋巴细胞与绵羊红细胞两者混合,可以 形成以T细胞为中心,周围黏附着多个绵羊红细胞的花环, 为E花环试验(erythrocyte rosette test)。应用最广 的有总E花环试验(Et,t为total的缩写)和活性E花环试 验(Ea,a为active 的缩写)。Et代表被检标本中T淋巴细 胞的总数,Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的T细 胞数,这部分T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫 功能和动态变化。 E花环试验主要用于了解机体细胞免疫功能。广泛应 用于肿瘤免疫、移植免疫及免疫性疾病的研究,为某些 疾病诊断和防治提供免疫学方面的重要参考。 二、实验原理
E玫瑰花环实验→判断细胞免疫功能 T淋巴细胞玫瑰 花结电镜照片 T淋巴细胞玫瑰 花结示意图
◼ E玫瑰花环实验→判断细胞免疫功能 T B T T淋巴细胞玫瑰 花结电镜照片 T淋巴细胞玫瑰 花结示意图
三、实验仪器、， 材料和试剂 1、材料 无菌抽取的人静脉血，加入事先有适量肝素 液的试管内，混匀抗凝。 健康绵羊红细胞 小牛血清（经56℃30min灭活）。按10：1加 入洗过的压积兔红细胞，混匀。于37℃吸收 30min,4c冰箱过夜。然后以2000r/min离 圈！ 心10min。取上清液经蔡氏滤器过滤后，无 菌条件下分装于小瓶。低温保存
三、实验仪器、材料和试剂 1、材料 ▪ 无菌抽取的人静脉血,加入事先有适量肝素 液的试管内,混匀抗凝。 ▪ 健康绵羊红细胞 ▪ 小牛血清（经56℃30min灭活）。按10：1加 入洗过的压积兔红细胞，混匀。于37℃吸收 30min，4℃冰箱过夜。然后以2000r/ min离 心10min。取上清液经蔡氏滤器过滤后，无 菌条件下分装于小瓶。低温保存
三、实验仪器、材料和试剂 2、试剂 > 抗凝剂：1%的肝素钠生理盐水溶液。 0.90%的生理盐水。 > Alsver's溶液。 Hank溶液。 细胞分层液：上海试剂二厂产品。 0.8%戊二醛溶液：使用前15min用生理盐水或 Hank液配制。 染色液：瑞氏或Giemsa染液。 1%醋酸溶液
三、实验仪器、材料和试剂 2、试剂 ➢ 抗凝剂：1%的肝素钠生理盐水溶液。 ➢ 0.90%的生理盐水。 ➢ Alsver‘s溶液。 ➢ Hank溶液。 ➢ 细胞分层液：上海试剂二厂产品。 ➢ 0.8%戊二醛溶液：使用前15min用生理盐水或 Hank液配制。 ➢ 染色液：瑞氏或Giemsa染液。 ➢ 1%醋酸溶液
三、实验仪器、材料和试剂 3、仪器 光学显微镜、离心机、水浴锅、血细胞计数 板、50UL微量加样器、医用剪刀及眼科镊 子、蔡氏滤器、刻度离心管(10ml)、滴管 及吸管、载玻片和盖玻片。 超
三、实验仪器、材料和试剂 3、仪器 ▪ 光学显微镜、离心机、水浴锅、血细胞计数 板、50UL微量加样器、医用剪刀及眼科镊 子、蔡氏滤器、刻度离心管（10ml）、滴管 及吸管、载玻片和盖玻片
四、方法与步骤 ■1.绵羊红细胞悬液的制备 依无菌手续从从绵羊颈静脉取血，放置4倍 体积的Alsver's液中，摇匀（放置4C冰 箱保存，限7~10天内用)。 临用前用Hank液洗涤3次，每次1000r,离 心5min。取压积的绵羊红细胞用Hank液配 成1%的细胞悬液（约2×107个/ml)
四、方法与步骤 ▪ 1.绵羊红细胞悬液的制备 ▪ 依无菌手续从从绵羊颈静脉取血，放置4倍 体积的Alsver’s 液中，摇匀（放置4℃冰 箱保存，限7～10天内用）。 ▪ 临用前用Hank液洗涤3次，每次1000r，离 心5min。取压积的绵羊红细胞用Hank液配 成1% 的细胞悬液（约2×107 个/ml）
四、方法与步骤 洗涤后悬浮的红血球 红血球在血球计数板上的密度
四、方法与步骤 洗涤后悬浮的红血球 红血球在血球计数板上的密度
四、方法与步骤 ·2.淋巴细胞的分离和制备 >取1支洁净、干燥的离心管加入 血浆 人抗凝血1ml,再加入1 nl Hanks Hank's液 液稀释血液； 血小板 >取1支洁净、干燥的离心管，加 淋巴细羽 入1ml细胞分层液； 分离液 >用吸管吸取上述稀释血液，沿 粒细胞 离心管管壁加于细胞分层液的 红细胞 表面（不能冲乱液面）。以 3000r/min离心20min,可出现 密度梯度离心分离纯 化淋巴细胞示意图 分层，详见图
密度梯度离心分离纯 化淋巴细胞示意图 四、方法与步骤 ▪ 2.淋巴细胞的分离和制备 ➢取1支洁净、干燥的离心管加入 人抗凝血1ml，再加入1mlHanks 液稀释血液； ➢取1支洁净、干燥的离心管，加 入1ml细胞分层液； ➢用吸管吸取上述稀释血液，沿 离心管管壁加于细胞分层液的 表面（不能冲乱液面）。以 3000r/min离心20min，可出现 分层，详见图