XINJIANG UNIVERSITY 实验八 植物细胞骨架的光学显微观察 College of Life Science and Technology,XINJIANG Univercity
实验 八 植物细胞骨架的光学显微观察 College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity
一.实验目的 1、了解植物细胞骨架的整体形态、分布 和结构特征； 2、初步掌握植物细胞骨架制片技术
一.实验目的 1、了解植物细胞骨架的整体形态、分布 和结构特征； 2、初步掌握植物细胞骨架制片技术
二.实验原理 细胞骨架(cytoskeleton)是指细胞中由蛋白 质纤维组成的复杂网状结构，根据其组成成分 和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维，呈纵 横交错的网络形式存在。它们对细胞的形态维 持，细胞生长、运动、分裂、分化，物质运输， 能量交换，信息传递，基因表达等起到重要作 用
细胞骨架(cytoskeleton)是指细胞中由蛋白 质纤维组成的复杂网状结构，根据其组成成分 和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维,呈纵 横交错的网络形式存在。它们对细胞的形态维 持，细胞生长、运动、分裂、分化，物质运输， 能量交换，信息传递，基因表达等起到重要作 用。 二.实验原理
二 实验原理 当用适当浓度的Triton X-100（非离子型去 垢剂)处理细胞适当的时间时，可溶解抽提 质膜中的蛋白质和全部脂质以及胞质中可溶 性蛋白，但细胞骨架系统的蛋白质耐受性较 好，因而被保留.经用戊二醛固定，考马斯亮 蓝R250染色后，可在光学显微镜下观察到由 微丝组成的微丝束，它在洋葱内表皮细胞中 以纵横交错的网状结构出现
当用适当浓度的Triton X-100（非离子型去 垢剂）处理细胞适当的时间时，可溶解抽提 质膜中的蛋白质和全部脂质以及胞质中可溶 性蛋白，但细胞骨架系统的蛋白质耐受性较 好,因而被保留.经用戊二醛固定，考马斯亮 蓝R250染色后，可在光学显微镜下观察到由 微丝组成的微丝束，它在洋葱内表皮细胞中 以纵横交错的网状结构出现。 二.实验原理
三.实验仪器、材料和试剂 (1)仪器、用具： 普通光学显微镜、恒温水浴锅、50ml烧杯、 玻璃滴管、表面皿、载玻片、盖玻片、尖镊 子、刀片、剪刀、吸水纸、檫镜纸等。 (2)材料： 洋葱鳞茎
⑴仪器、用具： 普通光学显微镜、恒温水浴锅、50ml烧杯、 玻璃滴管、表面皿、载玻片、盖玻片、尖镊 子、刀片、剪刀、吸水纸、檫镜纸等。 ⑵材料： 洋葱鳞茎 三.实验仪器、材料和试剂
三.实验仪器、材料和试剂 (3)试剂 ①M-缓冲液：50mmol/L咪唑、50mmol/LKCl、 0.5mmol/L MgCI2、1mmol/L EGTA[乙二醇双 (a-氨基乙基)醚四乙酸]、1.0mmoI/L EDTA、 1mmol/L巯基乙醇或DTT（二硫苏糖醇)。 ②6mmol/L（pH6.8)磷酸缓冲液。 ③1%Triton X-100,用M-缓冲液配制
⑶试剂 ①M-缓冲液：50mmol/L咪唑、50mmol/L KCl、 0.5mmol/L MgCl2 、1mmol/L EGTA[乙二醇双 （α-氨基乙基）醚四乙酸]、1.0mmol/L EDTA、 1mmol/L巯基乙醇或DTT（二硫苏糖醇）。 ②6mmol/L（pH6.8）磷酸缓冲液。 ③1%Triton X-100，用M-缓冲液配制。 三.实验仪器、材料和试剂
三.实验仪器、材料和试剂 (3)试剂 ④0.2%考马斯亮蓝R250,其溶剂为：甲 醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml。 ⑤3%戊二醛（用②液配制)。 ⑥50%乙醇 ⑦70%乙醇 ⑧95%乙醇。 其它试剂：叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性树胶
⑶试剂 ④0.2%考马斯亮蓝R250，其溶剂为：甲 醇 46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml。 ⑤3%戊二醛（用②液配制）。 ⑥50% 乙醇 ⑦70% 乙醇 ⑧95%乙醇。 其它试剂：叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性树胶。 三.实验仪器、材料和试剂
四.方法与步骤 1.撕取洋葱鳞茎内表皮（约1cm大小若干片) 置于盛有20mlpH6.8磷酸缓冲液的小烧杯中， 用滴管吹打，使其下沉。 2.待材料下沉后，吸弃磷酸缓冲液，加入20ml 1%Triton X-100液，处理25min。 3.吸弃Triton X-100液，用M-缓冲液轻轻洗涤 3次，每次3min,吸干溶液。 4.加入20ml3%戊二醛溶液，固定20min
1.撕取洋葱鳞茎内表皮（约1cm2大小若干片） 置于盛有20ml pH6.8磷酸缓冲液的小烧杯中， 用滴管吹打，使其下沉。 2.待材料下沉后，吸弃磷酸缓冲液，加入20ml 1% Triton X-100液，处理25min。 3.吸弃Triton X-100液，用M-缓冲液轻轻洗涤 3次，每次3min，吸干溶液。 4.加入20ml 3%戊二醛溶液，固定20min。 四.方法与步骤
四.方法与步骤 ■ 5.吸弃固定液，再用pH6.8磷酸缓冲液洗 3次，每次5min。 ■ 6.吸弃磷酸缓冲液，加入10ml0.2%考马 斯亮蓝R250染色液染色10min。 7.用蒸馏水洗2次，洗去背景色，将材料块 置于载玻片上，展平（保留一滴水)， 加盖玻片，在普通光学显微镜下观察
◼ 5.吸弃固定液，再用pH6.8磷酸缓冲液洗 3次，每次5min。 ◼ 6.吸弃磷酸缓冲液，加入10ml 0.2%考马 斯亮蓝R250染色液染色10min。 7.用蒸馏水洗2次，洗去背景色，将材料块 置于载玻片上，展平（保留一滴水）， 加盖玻片，在普通光学显微镜下观察。 四.方法与步骤
四.方法与步骤 8.如结果好，可制成永久切片，方法是： 将样品块在小烧杯中顺次通过如下试剂： 脱水：50%名醇-70%乙醇-95%乙醇-95%乙醇：叔 丁醇为1：1-叔丁醇（每级保留5-10min)[或正 丁醇一正丁醇] 透明：二甲苯-二甲苯（每级5-10mi)。然后捞出 样品，平展于载玻片上，加一小滴中性树胶，盖 上盖玻片，即成永久封片
8.如结果好，可制成永久切片，方法是： 将样品块在小烧杯中顺次通过如下试剂： 脱水：50%乙醇-70%乙醇-95%乙醇-95%乙醇：叔 丁醇为1：1-叔丁醇（每级保留5-10min）[或正 丁醇-正丁醇] 透明：二甲苯-二甲苯（每级5-10mi）。然后捞出 样品，平展于载玻片上，加一小滴中性树胶，盖 上盖玻片，即成永久封片。 四.方法与步骤