KINJIANG UNIVERSITY 实验十 PEG法诱导鸡血细胞融合 College of Life Science and Technology,XINJIANG Univercity
实验 十 PEG法诱导鸡血细胞融合 College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity
一、实验目的 ■ 了解聚乙二醇(PEG)诱导体外细胞融合 的基本原理。 通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验， 初步掌握细胞融合的基本方法
一、实验目的 ◼ 了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合 的基本原理。 ◼ 通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验， 初步掌握细胞融合的基本方法
二、实验原理 ■细胞融合（cell fusion)又称体细胞杂交，是指 用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核 体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩 溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含 有一个细胞核的杂种细胞(hybrid cell)。 ■ 细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免 疫、病毒和肿瘤的重要手段。依据融合过程采用的 助融剂的不同，细胞融合可分为：病毒诱导的细胞 融合，如仙台病毒(hemagglutinating virus of Japan,HVU);化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二 醇(pol yethyleneglycol,PEG);电场诱导的细胞 融合；激光诱导的细胞融合
二、实验原理 ◼ 细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交，是指 用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核 体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩 溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含 有一个细胞核的杂种细胞（hybrid cell）。 ◼ 细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免 疫、病毒和肿瘤的重要手段。依据融合过程采用的 助融剂的不同，细胞融合可分为：病毒诱导的细胞 融合，如仙台病毒(hemagglutinating virus of Japan,HVJ);化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二 醇（polyethyleneglycol ,PEG）;电场诱导的细胞 融合；激光诱导的细胞融合
·聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细 胞 接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于 两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此 的表面张力作用，使细胞发生融合。 ·细胞融合的频率和活力与所用PEG分子质量、浓度、 作用时间、细胞的生理状态与密度等有关
• 聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细 胞 接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于 两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此 的表面张力作用，使细胞发生融合。 • 细胞融合的频率和活力与所用PEG分子质量、浓度、 作用时间、细胞的生理状态与密度等有关
骨髓间质充质干细胞移植后的细胞融合
骨髓间质充质干细胞移植后的细胞融合
荧光标记的细胞融合
荧光标记的细胞融合
三.实验仪器、材料和试剂 ■仪器、用具：注射器、刻度离心管、离心 机、血细胞记数板、水浴锅、滴管、显微 镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、 酒精灯等。 ■材料：成年家鸡
三．实验仪器、材料和试剂 ◼ 仪器、用具：注射器、刻度离心管、离心 机、血细胞记数板、水浴锅、滴管、显微 镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、 酒精灯等。 ◼ 材料：成年家鸡
试剂 (1)0.85%NaC1溶液： (2)GKN:8.0gNaCl,0.4g KCI,1.77g Na2HPO4-2H20, 0.69gNaH2P04H20,2.0g葡萄糖，0.01g酚红，溶于 1000ml重蒸水中。 (3)50%(mw)PEG溶液：取50gPEG(相对分子量=4000)放 入100ml瓶中，高压灭菌20mim。让PEG冷却至50-60℃， 勿让其凝固。加入50ml预热至50℃的GKN液，混匀，置 37℃备用。 (4)Hanks原液(10×)：NaCI80.0g;Na2HP0412H201.2g; KC14.0g;KH2P040.6g;MgS047H202.0g; 葡萄糖10.0g;CaCl21.4g
（1）0.85%NaCl溶液: （2）GKN液：8.0gNaCl，0.4g KCl,1.77 g Na2HPO4·2H2O， 0.69 g NaH2PO4·H2O，2.0g葡萄糖，0.01g酚红，溶于 1000ml重蒸水中。 （3）50%（m/v）PEG溶液：取50gPEG(相对分子量=4000)放 入100ml瓶中，高压灭菌20min。让PEG 冷却至50-60℃， 勿让其凝固。加入50ml预热至50℃的GKN 液，混匀，置 37℃备用。 （4） Hanks原液(10×)： NaCl 80.0g；Na2HPO4·12H2O1.2g； KCl 4.0g；KH2PO4 0.6g；MgSO4·7H2O 2.0g； 葡萄糖 10.0g；CaCl2 1.4g。 ■ 试剂
称取1.4g的CaC12,融于30-50ml的重蒸水中。取 1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml于烧 杯中，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。必须在前 一药品完全溶解后，方可加入下一药品，直到葡萄糖完 全溶解后，再将已溶解的CaC12溶液加入，最后加水至 1000ml。 (6)Hanksi液：Hanks.原液100ml,加重蒸水896ml, 加0.5%酚红4ml。配好的Hanks液，分装包扎好 贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。 (7)詹纳斯绿染液
称取1.4g的CaCl2，融于30-50ml的重蒸水中。取 1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml于烧 杯中，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。必须在前 一药品完全溶解后，方可加入下一药品，直到葡萄糖完 全溶解后，再将已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水至 1000ml。 （6）Hanks液：Hanks原液100 ml，加重蒸水896 ml， 加0.5%酚红 4 ml。配好的Hanks液，分装包扎好 贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。 （7）詹纳斯绿染液
四、方法与步骤 (一)鸡血细胞的体外融合 1.鸡血细胞的获得 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血， 注入试管后，速加入肝素(100U肝素/5ml全血)混合，制 成抗凝全血。 2.鸡血细胞储备液的制备 在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85%NaC1溶液，制 成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。 3、鸡血细胞悬液的制备 取细胞悬液1mlL,加4mL0.85‰NaCl溶液混匀，1200r/min离 心5min,弃上清液，再加入5ml0.85%NaCl溶液按上述条件 离心两次(5分钟，10分钟)。最后，弃去上清液，加入 10ml的GKN溶液，制成鸡血细胞悬液。吸取0.5ml鸡血细胞 悬液，加入4.5mI的GKN液进行稀释
（一）鸡血细胞的体外融合 1.鸡血细胞的获得 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血， 注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制 成抗凝全血。 2.鸡血细胞储备液的制备 在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85%NaCl溶液，制 成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。 3、鸡血细胞悬液的制备 取细胞悬液1mL，加4mL0.85%NaCl溶液混匀，1200r/min离 心5min，弃上清液，再加入5ml 0.85%NaCl溶液按上述条件 离心两次（5分钟，10分钟）。最后，弃去上清液，加入 10ml的GKN溶液，制成鸡血细胞悬液。吸取0.5ml鸡血细胞 悬液，加入4.5ml的GKN液进行稀释。 四、方法与步骤