实验四 植物细胞的脱分化与再分化 19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment
19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 1 植物细胞的脱分化与再分化 实验四
+实验目的 1、熟练掌握植物组织培养的基本技术 2、通过在超净工作台上进行无菌操作 训练,初步掌握组织培养的无菌操作 技术。 19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment
19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 2 实验目的 1、熟练掌握植物组织培养的基本技术； 2、通过在超净工作台上进行无菌操作 训练，初步掌握组织培养的无菌操作 技术
实验原理 1.植物组织培养概念(广义): 在无菌条件下,将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟 的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体 细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体(如脱壁后仍具 有生活力的原生质体),培养在人工配制的培养基上,给予适宜的培养条件 诱发产生愈伤组织,或潜伏芽等,或长成完整的植株,统称为植物组织培 养。 2.概念(狭义) 利用植物外植体在固体培养基上培养,获得愈伤组织或完整植株, 即为植物组织培养,也称离体培养或外植体培养。 19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment
实验原理 19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 3 1. 植物组织培养概念（广义）： 在无菌条件下，将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟 的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体 细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体(如脱壁后仍具 有生活力的原生质体)，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件， 诱发产生愈伤组织，或潜伏芽等，或长成完整的植株，统称为植物组织培 养。 2. 概念（狭义）： 利用植物外植体在固体培养基上培养，获得愈伤组织或完整植株， 即为植物组织培养，也称离体培养或外植体培养
背景 胞的分化发育潜能 ◆全能性:使后代细胞分化成各种组织细胞并建成完整个体的 潜能。 :受精卵 ◆多能性:使后代细胞分化出多种组织或细胞,但已不能建成 完整个体的潜能。 eg:生血多能干细胞 ◆专能性:后代干细胞只能发育成一种细胞 eg;:生血专能干细胞 2619/3/1 19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment
19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 4 4 2019/3/19 背景 全能性：使后代细胞分化成各种组织细胞并建成完整个体的 潜能。 eg: 受精卵 多能性：使后代细胞分化出多种组织或细胞，但已不能建成 完整个体的潜能。 eg: 生血多能干细胞 专能性：后代干细胞只能发育成一种细胞 eg: 生血专能干细胞 细胞的分化发育潜能
门背景 细胞的全能性如何实现 ◆体细胞是已分化的细胞。 ◆体细胞具有特定的遗传记忆。 ◆体细胞实现全能性的前提:必须消除已有的遗传 记忆,回到胚性状态。 ◆使体细胞回归胚性状态称为脱分化。 ◆脱分化的体细胞基因组必需重新程序化才能进 入胚胎发育过程,实现再分化。 19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment
背景 19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 5 细胞的全能性如何实现 体细胞是已分化的细胞。 体细胞具有特定的遗传记忆。 体细胞实现全能性的前提: 必须消除已有的遗传 记忆, 回到胚性状态。 使体细胞回归胚性状态称为脱分化。 脱分化的体细胞基因组必需重新程序化才能进 入胚胎发育过程, 实现再分化
利用外植体能培养出完整植株 完全在于高等植物细胞具有全能性 (形 取烟草根形成 烟草植株细胞培养愈伤组织发育成幼胚长成植物幼体 成熟植株 2619/3/1 19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment
19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 6 2019/3/19 利用外植体能培养出完整植株 完全在于高等植物细胞具有全能性
创实验材料、用品及试剂 材料 ①无菌烟草②新鲜的迎春花茎 仪器 超净工作台、培养箱 用具 镊子、剪刀、滤纸、记号笔、酒精灯、火柴、酒精棉花球 试剂与培养基 ■75%酒精 15%次氯酸钠 ■无菌双蒸水 ■去分化培养基、分化培养基 19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment
实验材料、用品及试剂 19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 7 材料 ①无菌烟草 ②新鲜的迎春花茎 仪器 超净工作台、培养箱 用具 镊子、剪刀、滤纸、记号笔、酒精灯、火柴 、酒精棉花球 试剂与培养基 75%酒精 15%次氯酸钠 无菌双蒸水 去分化培养基、分化培养基
实验内容 取材、消毒和接种 (一)实验前的准备工作 ◎在接种前4h打开紫外灯照射30mn。正式接种前30mn左右,打开超净工 作台上的紫外灯和风机。 迎春花枝条去叶,用水洗净茎段。剪取35cm长的枝条2-3段(在接种室外 剪好放入三角瓶),用肥皂水洗净双手,进入接种室。 ◎用75%的酒精擦拭工作台面和双手。用蘸有75%酒精的纱布擦拭装有培养 基的培养器皿,放进工作台。酒精棉擦拭剪刀、镊子等器械过后放在器械 架上。 19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment
实验内容 19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 8 取材、消毒和接种 在接种前4h打开紫外灯照射30min。正式接种前30min左右，打开超净工 作台上的紫外灯和风机。 迎春花枝条去叶，用水洗净茎段。剪取3-5cm长的枝条2-3段(在接种室外 剪好放入三角瓶)，用肥皂水洗净双手，进入接种室。 用75％的酒精擦拭工作台面和双手。用蘸有75％酒精的纱布擦拭装有培养 基的培养器皿，放进工作台。酒精棉擦拭剪刀、镊子等器械过后放在器械 架上。 （一） 实验前的准备工作
实验内容 (二)接种全过程 ◎将浸泡有茎段的三角瓶移入超净工作台(三角瓶在移入接种室前, 应用75%酒精擦拭瓶外),三角瓶中加入75%乙醇,浸泡30s,倒出 乙醇。倒入15%次氯酸钠溶液,消毒20min(浸泡时可轻轻摇动, 使植物材料与灭菌剂有良好的接触)。 *次氯酸钠消毒15min的时候可以将三角瓶封好口拿到超净台外面摇晃 ◎倒出次氯酸钠溶液,用无菌水冲洗3次,彻底清除残留茎段和瓶內 的次氯酸钠溶液。 ◎用镊子把茎段取出,剪去茎段头尾部分,用灭菌的吸水纸吸干水珠
19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 9 将浸泡有茎段的三角瓶移入超净工作台（三角瓶在移入接种室前， 应用75%酒精擦拭瓶外），三角瓶中加入75%乙醇，浸泡30s，倒出 乙醇。倒入15%次氯酸钠溶液，消毒20min（浸泡时可轻轻摇动， 使植物材料与灭菌剂有良好的接触 ）。 * 次氯酸钠消毒15min的时候可以将三角瓶封好口拿到超净台外面摇晃 倒出次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗3次，彻底清除残留茎段和瓶内 的次氯酸钠溶液。 用镊子把茎段取出，剪去茎段头尾部分，用灭菌的吸水纸吸干水珠。 （二） 接种全过程 实验内容
实验内容 培养与观察 ●迎春花茎段16℃暗培养3-4天,观察有无染菌。 ●挑取无染菌的茎段,转入新的脱分化培养基,继续暗 培养7天,可观察到愈伤组织开始生长 °无菌烟草叶片不用消毒,直接将叶片成的 小接入脱分化培养基。7天后将烟草愈伤组织转接到 细胞分化培养基,光照23周,可以观察到细胞分化 产生新的苗。 19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment
19/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 10 实验内容 迎春花茎段16℃暗培养3-4天，观察有无染菌。 挑取无染菌的茎段，转入新的脱分化培养基，继续暗 培养7天，可观察到愈伤组织开始生长。 无菌烟草叶片不用消毒，直接将叶片剪成约1cm2大 小接入脱分化培养基。7天后将烟草愈伤组织转接到 细胞分化培养基，光照2-3周，可以观察到细胞分化 产生新的苗。 培养与观察