叶绿体的分离、纯化和鉴定
叶绿体的分离、纯化和鉴定
背景与原理 细胞器分离、纯化在细胞生物学研究中的意义 基智肥强的囊缇粑先窠入势些 与功能的 细胞器分离、纯化的主要方法和原理 根据细胞器的古少形述密管物理特性差 技菜心卷辖组公箱度 >细胞器分离、纯化过程中的主要注意事项 尽可能保持所分离细胞器的生物活性,包括匀 浆缓冲液(渗透压、pH、离子强度等)的选择 温度、时间等
背景与原理 细胞器分离、纯化在细胞生物学研究中的意义 细胞器的形成是真核细胞生命活动功能区域化 的基础，细胞器的分离、纯化是深入研究亚细胞 结构与功能的基础。 细胞器分离、纯化的主要方法和原理 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差 异，离心成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用 的技术，主要包括差速离心、和密度梯度离心等 方法。 细胞器分离、纯化过程中的主要注意事项 尽可能保持所分离细胞器的生物活性，包括匀 浆缓冲液（渗透压、pH、离子强度等）的选择、 温度、时间等
梯度介质的选择 1、蔗糖具备足够大的溶解度,以形成所需的密度梯度范围; 低温下黏度高,扩散慢 2、蔗糖不会与样品中的组分发生反应。 3、蔗糖不会引起样品中组分的凝集、变性或失活,没有毒 性。 4、蔗糖浓度大时渗透压不大。 4、蔗糖PH值中性。 5、蔗糖成本低,易获得 R C F 端器小颗粒 大颗粒 混合液 离心开始后 离心结束 时间
梯度介质的选择 1、蔗糖具备足够大的溶解度，以形成所需的密度梯度范围； 低温下黏度高，扩散慢。 2、蔗糖不会与样品中的组分发生反应。 3、蔗糖不会引起样品中组分的凝集、变性或失活，没有毒 性。 4、蔗糖浓度大时渗透压不大。 4、蔗糖PH值中性。 5、蔗糖成本低，易获得
内膜 基质类囊体基粒 基粒类囊体 叶绿体 母系遗传( maternal inheritance) 基质 W 类囊体腔 叶绿体的结构(引自wol,1993) chup1 CX) ThePlantCelVol.15,2805-2815,December2003,www.plantcelorg2003AmericanSocietyofPantBiologists CHLOROPLAST UNUSUAL POSITIONING1 Is Essential for Proper chloroplast Positioning umio Takahashi, b Takeshi Kanegae, Yasuo Niwa, Akeo Kadota, and Masamitsu Wada bA Department of Biology, Faculty of Science, Graduate School of Tokyo Metropolitan University, Hachioji, Tokyo 192-0397, Japan Solution Oriented Research for Science and Technology, Japan Science and Technology Corporation, Kawaguchi, Saitama 3320012, Japan
叶绿体 叶绿体的结构(引自Wolf，1993） 母系遗传（maternal inheritance）
实验目的 掌握叶绿体分离技术 >观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,熟悉荧光显微镜的 使用
实验目的 掌握叶绿体分离技术 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，熟悉荧光显微镜的 使用
实验材料、仪器和试剂 ≯材料:新鲜菠菜 ≯仪器:普通光学显微镜、荧光显微镜、普通离心机、研 钵、剪刀、玻璃皿等 试剂:匀浆介质(0.25mo/蔗糖,0.05 mol/L Tris-HC|缓 冲液ph=74) 50%蔗糖溶液,15%蔗糖溶液,0.01%吖啶橙
实验材料、仪器和试剂 材料：新鲜菠菜 仪器：普通光学显微镜、荧光显微镜、普通离心机、研 钵、剪刀、玻璃皿等 试剂：匀浆介质（0.25mol/L蔗糖，0.05mol/L Tris-HCl 缓 冲液 ph=7.4） 50%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液，0.01%吖啶橙
实验步骤 1选取菠菜叶片(选择録色的新鲜叶片),洗净擦干后去除 叶梗和粗脉,撕成小碎块(剪碎更宜碾 称2~3g放于玻 璃匀浆器中 2加入预冷(放在冰上)到匀浆介质10m,在冰上用研 钵研磨。 3捣碎液用尼龙网过滤于50m烧杯中。 4将滤液平分到2个离心管中(2m),1000min下离心1min(离 轻轻吸取上清液。 5.在2.oml离心管内依次加入50%蔗糖溶液0.9m和15%蔗糖溶液 0.5m 离心营壁注 6.小心地沿离心管壁加入04m上清液。 7.离心8000r/min,20min。 8.取出离心管,可见叶绿体在密度梯度液中间形成带
实验步骤 1.选取菠菜叶片（选择嫩绿色的新鲜叶片），洗净擦干后去除 叶梗和粗脉，撕成小碎块（剪碎更宜碾磨），称2~3g放于玻 璃匀浆器中 2.加入预冷（放在冰上预冷）到0℃匀浆介质10ml，在冰上用研 钵研磨。 3.捣碎液用尼龙网过滤于50ml烧杯中。 4.将滤液平分到2个离心管中（2ml），1000r/min下离心1min(离 心机配平)， 轻轻吸取上清液。 5. 在2.0ml离心管内依次加入50%蔗糖溶液0.9ml和15%蔗糖溶液 0.5ml（注意15%蔗糖溶液要缓缓沿离心管壁注入，不能搅动 50%蔗糖液面）。 6. 小心地沿离心管壁加入0.4ml上清液。 7. 离心8000r/min, 20 min。 8. 取出离心管，可见叶绿体在密度梯度 液中间形成带
9用吸管对准叶绿体那一层吸取一滴叶绿体悬液滴于载片上 加盖片观察 1)在普通光镜下观察 2)在荧光显微镜下观察直接荧光; 3)在荧光显微镜下观察间接荧光(取叶绿体悬液一滴滴 在无荧光载玻片上,再加一滴0.01%的吖啶橙,盖上盖玻片 后用荧光观察) 10.因为温度、光、淬灭剂等原因,请尽快拍照
9.用吸管对准叶绿体那一层吸取一滴叶绿体悬液滴于载片上， 加盖片观察： 1）在普通光镜下观察； 2）在荧光显微镜下观察直接荧光； 3）在荧光显微镜下观察间接荧光（取叶绿体悬液一滴滴 在无荧光载玻片上，再加一滴0.01%的吖啶橙，盖上盖玻片 后用荧光观察） 10.因为温度、光、淬灭剂等原因，请尽快拍照
菠菜叶片切片观察 在普通显微镜下可以看到三种细胞:表皮细胞(边缘呈锯 齿形的鳞片状细胞)、保卫细胞(构成气孔的成对存在的 肾形细胞)、叶肉细胞(为排成栅状的长形和椭圆形细 胞)。 在荧光显微镜下直接观察,叶绿体发出火红色荧光,但其 荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光。吖啶橙染 色后观察比较
菠菜叶片切片观察 在普通显微镜下可以看到三种细胞：表皮细胞（边缘呈锯 齿形的鳞片状细胞）、保卫细胞（构成气孔的成对存在的 肾形细胞）、叶肉细胞（为排成栅状的长形和椭圆形细 胞）。 在荧光显微镜下直接观察，叶绿体发出火红色荧光，但其 荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光。吖啶橙染 色后观察比较
讨论 优化方法 (1)为防止光合作用形成的淀粉颗粒在离心时破 坏叶绿体,在提取叶绿体前,先将植物材料暗置 过夜。 (2)细胞破碎时,不必过细。用普通的家用食品 料理机匀浆2min同样可以达到很好的效果。此 外,过滤时不要用力挤压,以避免对叶绿体被膜 的破碎。在用细胞器分离缓冲液悬浮叶绿体粗提 物时应轻缓,在冰上轻轻晃动使叶绿体分散开来
讨论 优化方法 (1)为防止光合作用形成的淀粉颗粒在离心时破 坏叶绿体，在提取叶绿体前，先将植物材料暗置 过夜。 (2)细胞破碎时，不必过细。用普通的家用食品 料理机匀浆2 min同样可以达到很好的效果。此 外，过滤时不要用力挤压，以避免对叶绿体被膜 的破碎。在用细胞器分离缓冲液悬浮叶绿体粗提 物时应轻缓，在冰上轻轻晃动使叶绿体分散开来