哺乳动物离体贴壁细胞的传代培养 SCHOO
哺乳动物离体贴壁细胞的传代培养
目的 1·熟悉实验原理 2 掌握细胞传代的操作 3 学习细胞计数
1 • 熟悉实验原理 2 • 掌握细胞传代的操作 3 • 学习细胞计数 目的
实验原理 细胞生长类型: ◎生长的细胞 贴壁型细胞:附着在某一固相支持物表面才能 县 悬浮状态下節可 牌必附着于固相支持物表面,在 數细胞类型棗螽瘟翱磨纽瞿挐态下星。 但是为什么贴壁细胞能贴壁,是否思考过? 为什么要传代 細胞在培养瓶中长成致密单层后,已基本饱 为使细 续生 传代培养 保存下丢的方 法,也是利用培养细胞迸行客种实的必经过程
一、实验原理 • 细胞生长类型： ——贴壁型细胞：附着在某一固相支持物表面才能 生长的细胞。 ——悬浮型细胞：不必附着于固相支持物表面，在 悬浮状态下即可生长的细胞。 ——绝大多数有机体细胞属于贴壁型细胞，只有少 数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 ——但是为什么贴壁细胞能贴壁，是否思考过？ • 为什么要传代： ——细胞在培养瓶中长成致密单层后，已基本饱和； 为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就要进行 传代（再培养）。传代培养使一种将细胞株保存下去的方 法，也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程
实验原理一—贴壁生长细胞的 生长过程 游离期or悬浮期 细胞接种后在培养基中处于悬浮状态,细胞质回缩, 胞体呈圆球形。 贴壁期: 细胞附着于胶原、玻璃、塑料或其它细胞等底物上, 细胞株平均于10min-4h贴壁 ·潜伏期: 细胞有生长活动,但无细胞分裂,一般为6-24h。 ·对数生长期 一细胞数随时间变化成倍增长,活力最佳;适合进行各种实验 平台期: 细胞长满瓶底后,虽有活力但不再分裂
一、实验原理——贴壁生长细胞的 生长过程 • 游离期or悬浮期： ——细胞接种后在培养基中处于悬浮状态，细胞质回缩， 胞体呈圆球形。 • 贴壁期： ——细胞附着于胶原、玻璃、塑料或其它细胞等底物上， 细胞株平均于10min－4h贴壁。 • 潜伏期： ——细胞有生长活动，但无细胞分裂，一般为6-24h。 • 对数生长期： ——细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳；适合进行各种实验。 • 平台期： ——细胞长满瓶底后，虽有活力但不再分裂
二、实验准备一—试剂配制or购买 培养基 不同细胞有不同的适合培养基,养细胞前需查清楚。大多数培养基中使 用酚红作为pH指示剂红色代表中性,黄色代表酸性,紫色代表碱性。 很多细胞的培养基中需要加入血清:血清最好放置在-20℃,解冻时应 先置于4℃融解,融解过程必须规则摇晃均匀。(思考:血清是否应该灭活?) 此次实验为RPM1640完全培养基(需添加5% NaHco3,小牛血清, 霉素,链霉素和谷氨酰胺) 缓冲液 -一—磷酸盐溶液( Phosphate Buffered Saline,PBS)、 Hanks液orD- Hanks 液 消化液 可以使用0.25%胰酶、0.05%胰酶 for edta溶液;若胰酶是自己配制,则 要用不含钙、镁离子及血清的平衡盐溶液。 添加剂 谷氨酰胺:合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,作为核酸和蛋白质 的合成原料;注意:其在溶液中很不稳定,4℃仅能存放两周。 HEPES:羟乙基哌嗪乙硫磺酸,用于防止培养基p迅速变动
二、实验准备——试剂配制or购买 • 培养基 ——不同细胞有不同的适合培养基，养细胞前需查清楚。大多数培养基中使 用酚红作为pH指示剂红色代表中性，黄色代表酸性，紫色代表碱性。 ——很多细胞的培养基中需要加入血清：血清最好放置在-20℃，解冻时应 先置于4℃融解，融解过程必须规则摇晃均匀。（思考：血清是否应该灭活？） ——此次实验为RPMl1640完全培养基（需添加5％NaHCO3，小牛血清， 青霉素，链霉素和谷氨酰胺）。 • 缓冲液 ——磷酸盐溶液（Phosphate Buffered Saline,PBS）、Hanks液or D-Hanks 液 • 消化液 ——可以使用0.25%胰酶、0.05%胰酶or EDTA溶液；若胰酶是自己配制，则 要用不含钙、镁离子及血清的平衡盐溶液。 • 添加剂 ——谷氨酰胺：合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，作为核酸和蛋白质 的合成原料；注意：其在溶液中很不稳定，4℃仅能存放两周。 ——HEPES：羟乙基哌嗪乙硫磺酸，用于防止培养基pH迅速变动
二、实验准备一—熟悉实验材料 293T,人胚肾上皮细胞系293经过腺病毒转染,能表达SW40大T抗原 ATCC Number: CRL-3216 http://www.atcc.org http://www.cellbank.org.cn/index.as P
二、实验准备——熟悉实验材料 293T，人胚肾上皮细胞系293经过腺病毒转染，能表达SV40大T抗原 http://www.atcc.org http://www.cellbank.org.cn/index.as p
、实验操作一一本次实验步骤 洗净双手,入无菌室缓冲间穿戴工作服、帽子、口罩后进入无菌 室 2.点燃煤气或酒精),用巧5‰%乙醇棉球抹拭双手、操作台表面 各种试剂瓶口和瓶身。 、3消化细胞。取接种3-5天已形成单层细胞的培养皿,将原有培 养液弃去。吸取1-2mL的胰酶加入到培养皿内(从侧面加入,勿真 接冲洗细胞单层),轻摇数次后弃去。吸取2mL的消化液加入到 养皿内(丛侧面加入,勿直接冲洗细胞单层),轻摇数次使消化液 均匀分布在细胞表面。室温消化1--2min,待细胞单层上出现透明 针尖样 原时(此时镜检可见成片层的细胞收缩成圆形,细胞与 细胞之间相互接触松散或互不接触),弃去大部分消化液(留下100 200uL液体),然后迅速加入32m完全培养液进行中和,用Tip头吸 打细胞数次,使细胞团块成单,弃去1m细胞悬液。 4、细胞接种。吸出1m的细胞悬液在35mm培养皿内,再添加新鲜 的完全培养基1mL。混合均匀(前后或左右小幅晃动),编号,放 置到细胞培养箱内进行培养,隔天观察结果
三、实验操作——本次实验步骤 l. 洗净双手，入无菌室缓冲间穿戴工作服、帽子、口罩后进入无菌 室。 2．点燃煤气(或酒精)灯，用75％乙醇棉球抹拭双手、操作台表面、 各种试剂瓶口和瓶身。 3. 消化细胞。取接种3－5天已形成单层细胞的培养皿，将原有培 养液弃去。吸取1-2 mL的胰酶加入到培养皿内（丛侧面加入，勿直 接冲洗细胞单层），轻摇数次后弃去。吸取2mL的消化液加入到培 养皿内（丛侧面加入，勿直接冲洗细胞单层），轻摇数次使消化液 均匀分布在细胞表面。室温消化1—2min，待细胞单层上出现透明 针尖样小孔隙时（此时镜检可见成片层的细胞收缩成圆形，细胞与 细胞之间相互接触松散或互不接触)，弃去大部分消化液（留下100- 200 uL液体），然后迅速加入32mL完全培养液进行中和，用Tip头吸 打细胞数次，使细胞团块成单，弃去1ml细胞悬液。 4. 细胞接种。吸出1mL的细胞悬液在35mm培养皿内，再添加新鲜 的完全培养基1mL。混合均匀（前后或左右小幅晃动），编号，放 置到细胞培养箱内进行培养，隔天观察结果
三、实验操作一细胞计数 ·手工计数细胞:血细胞计数板 XB-K-25 0.10mm SMIC mm2 400 MADE IN CHINA Coulter计数仪
三、实验操作——细胞计数 • 手工计数细胞：血细胞计数板 • Coulter计数仪
三、实验操作一细胞计数 红状代表:个大方格 蓝色部分是百 绿和代教 蓝代表:个小防格 0. Imm XB-K-25 细率计数区域 每个大格面积为10m容积为01mm3( 400 mm A 2 B 血细胞计数板构造(一) A.正面图;B.纵切面图 1.血细胞计数板;2.盖玻片;3.计数室 计算公式:细胞数/ml=4大格细胞总数/4x稀释倍数×10~4
三、实验操作——细胞计数 计算公式：细胞数／ml＝4大格细胞总数／4×稀释倍数×10^4
三、实验操作一一细胞计数 用酒精棉球擦拭细胞计数板,自然晾干。取9ul消化后的 细胞悬液加1Q业合酚蓝染色液欺打均后吸取2细 计数板内(不能有气泡、空隙,也不能使其外溢以免定量 有误),在光学显微镜(10×10)下计数。 计算公式:细胞数/m=4大格细胞总数/4x稀释倍数×10~4
三、实验操作——细胞计数 用酒精棉球擦拭细胞计数板，自然晾干。取90ul消化后的 细胞悬液，加10ul台酚蓝染色液，吹打均匀后吸取10ul细 胞悬液（勿引入气泡）沿细胞计数板血盖片边沿轻轻加入 计数板内（不能有气泡、空隙，也不能使其外溢以免定量 有误），在光学显微镜(10×10)下计数。 计算公式：细胞数／ml＝4大格细胞总数／4×稀释倍数×10^4