《细胞生物学》教案（第21次课2学时）一、授课题目第十二章细胞增殖调控与癌细胞（Cellproliferation，regulation and cancer cell)二、教学目的和要求1.理解细胞周期不同时相在形态上和生物化学上的变化；2.掌握细胞周期的调控3.了解细胞周期的时间测定三、教学重点和难点教学重点：各种调控因子的作用教学难点：细胞周期调控的机理四、主要参考资料翟中和。细胞生物学，第三版北京：高等教育出版社，2007五、教学过程细胞增殖是通过严格调控的细胞周期来实现的，在细胞周期的不同阶段有一系列检查点对该过程进行严密监控。不然，不受约束而生成的细胞将被机体免疫系统所清除，或者癌变，转化为癌细胞。癌细胞不仅表现出增殖失控，同时还具有浸润和转移的特征，最终导致个体的死亡
《细胞生物学》教案 （第 21 次课 2 学时） 一、授课题目 第十二章 细胞增殖调控与癌细胞（Cell proliferation ， regulation and cancer cell） 二、教学目的和要求 1.理解细胞周期不同时相在形态上和生物化学上的变化； 2.掌握细胞周期的调控 3.了解细胞周期的时间测定. 三、教学重点和难点 教学重点：各种调控因子的作用 教学难点：细胞周期调控的机理 四、主要参考资料 翟中和． 细胞生物学， 第三版．北京：高等教育出版社，2007 五、教学过程 细胞增殖是通过严格调控的细胞周期来实现的，在细胞周期的不同阶段有一系列检 查点对该过程进行严密监控。 不然，不受约束而生成的细胞将被机体免疫系统所清除，或者癌变，转化为癌细 胞。癌细胞不仅表现出增殖失控，同时还具有浸润和转移的特征，最终导致个体的死 亡
第一节细胞周期的调控(Cell-CycleControl)细胞周期调控系统的主要作用（一)在适当时候激活细胞周期各时相的相关酶和蛋自，确保细胞周期向下一个阶段进行，然后自身失活（正调控）；台当细胞周期中出现异常时，细胞会启动一系列的负调控机制，使细胞停滞在某个特定的时期，这种调节机制可确保确保每一时相事件的全部完成（负调控）；白对外界环境因子起反应（如多细胞生物对增殖信号的反应）通过酪氨酸蛋白激酶受体偶联的信号通路完成信号向细胞内的传递。二细胞周期检验点（CellCycleCheckpoint)检验点（checkpoint）：在细胞周期中，决定细胞周期能否继续向前运转的某一特定时期，称为检验点。（)细胞周期检验点是指存在于细胞周期中特定时期的一种调控细胞周期运转的机制，主要是确保周期每一时相事件的有序、全部完成并与外界环境因素相联系；细胞周期检验点及其作用：GI期检验点：酵母Startpoint;动物细胞RestrictionPoint.RestingSpindleAssembly CheckpointstateCheckfor:ChromosomeattachmenttospindleG2CheckpointCheckfor:·CellsizeMDNAreplicationG1CheckpointG2G1Checkfor:.Cell sizeNutrientsGrowthfactorsS·DNAdamage(DNAsynthesis)Restingstate (GO)
第一节 细胞周期的调控(Cell-Cycle Control) 一 细胞周期调控系统的主要作用 ㈠在适当时候激活细胞周期各时相的相关酶和蛋白，确保细胞周期向下一个阶段进行， 然后自身失活（正调控）； ㈡当细胞周期中出现异常时，细胞会启动一系列的负调控机制，使细胞停滞在某个特定 的时期，这种调节机制可确保确保每一时相事件的全部完成（负调控）； ㈢对外界环境因子起反应（如多细胞生物对增殖信号的反应）通过酪氨酸蛋白激酶受体 偶联的信号通路完成信号向细胞内的传递。 二 细胞周期检验点 (Cell Cycle Checkpoint) 检验点（checkpoint）：在细胞周期中，决定细胞周期能否继续向前运转的某一特定时 期，称为检验点。 ㈠细胞周期检验点是指存在于细胞周期中特定时期的一种调控细胞周期运转的机制，主 要是确保周期每一时相事件的有序、全部完成并与外界环境因素相联系； ㈡细胞周期检验点及其作用； G1 期检验点： 酵母 —— Start point； 动物细胞 —— Restriction Point
本质：周期性活化的蛋白激酶G1/S检验点：启动DNA的复制S期检验点：检验DNA复制是否完毕G2/M检验点：能否开始分裂中-后期检验点：纺锤体组装的检验三MPF(Maturation-promotingfactor,Mitosis-promotingfactor)卵细胞成熟促进因子（maturationpromotingfactor，MPF），又称细胞有丝分裂促进因子(Mitosis-promotingfactor)早期称为M期促进因子(M-phasepromotingfactor,MPF)，是指M期细胞中存在的促进细胞分裂的因子TransitionfromG2toM：促使细胞从G2期进入M期()MPF的发现及其生化实质；1.细胞融合与PCC(Prematurechromosomalcondense);最早做的是上个世纪70年代，用M期的HeLa细胞（人的宫颈癌细胞，人类历史上第一个被体外培养成功的动物细胞）；将HeLa细胞同步化在M期，然后将M期的HeLa细胞和袋鼠的肾细胞PtK间期不同时期（G1,S,G2）的细胞分别融合，观察其形态变化；发现G1期的染色体提前凝案了，PCC（早熟染色体凝集）：与M期细胞融合的间期细胞发生了形态各异的染色体凝集，称之为早熟染色体凝集。不同时相的间期细胞与M期细胞融合，产生的PCC形态各异：G1期PCC为细单线状（因DNA未复制），S期PCC为粉末状（因DNA由多个部位开始复制），G2期PCC为双线染色体状（说明DNA复制已完成），这样的形态变化可能与DNA复制状态有关。结论：既然M期细胞可以诱导PCC，提示在M期细胞中可能存在一种诱导染色体凝集的因子，称为细胞促成熟因子
本质：周期性活化的蛋白激酶 G1/S 检验点 ：启动 DNA 的复制 S 期检验点：检验 DNA 复制是否完毕 G2/M 检验点：能否开始分裂 中-后期检验点：纺锤体组装的检验 三 MPF(Maturation-promoting factor, Mitosis-promoting factor) 卵细胞成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF）, 又称细胞有丝分裂促进因子(Mitosis-promoting factor), 早期称为 M 期促进因子(M-phase promoting factor, MPF)， 是指 M 期细胞中存在的促进细胞分裂的因子 Transition from G2 to M：促使细胞从 G2 期进入 M 期 ㈠MPF 的发现及其生化实质； 1. 细胞融合与 PCC ( Premature chromosomal condense)； 最早做的是上个世纪 70 年代，用 M 期的 HeLa 细胞（人的宫颈癌细胞，人类历史 上 第一个被体外培养成功的动物细胞）；将 HeLa 细胞同步化在 M 期，然后将 M 期的 HeLa 细胞和袋鼠的肾细胞 PtK 间期不同时期（G1, S, G2）的细胞分别融合，观察其形 态变化； 发现 G1 期的染色体提前凝聚了， PCC（早熟染色体凝集）：与 M 期细胞融合的间期细胞发生了形态各异的染色体凝集， 称之为早熟染色体凝集。 不同时相的间期细胞与 M 期细胞融合，产生的 PCC 形态各异： G1 期 PCC 为细单线状（因 DNA 未复制）， S 期 PCC 为粉末状（因 DNA 由多个部位开始复制）， G2 期 PCC 为双线染色体状（说明 DNA 复制已完成）， 这样的形态变化可能与 DNA 复制状态有关。 结论：既然 M 期细胞可以诱导 PCC，提示在 M 期细胞中可能存在一种诱导染色体凝集 的因子，称为细胞促成熟因子
（人M期HeLa细胞与袋鼠（Ptk)G、S、Gz期细胞融合诱导PCC：发现染色质提前凝聚，称为早熟染色体凝集，简称PCC；G期为细单线状；S期为粉末状；G2期为双线染色体状）（提示：在M期细胞中存在诱导PCC的因子!!!）M期人染色体M期人染色体M期人染色体R8茶G2期G.期M期S期M期MJ0I8小8诱导PtkG2期细胞染色体语导PtkG.期细胞染色体诱导PtkS期细胞染色体明人染色体6MM期人Tn4人染色体人染色体M期细胞与G1（A）、S（B）和G2（C）期细胞融合诱导早熟染色体凝缩（PCC）爪蟾卵子成热过程；2.用非洲爪蟾来做实验，仍然提出了MPF这个概念；为什么用非洲爪蟾的卵母细胞来做这个实验，因为其卵母细胞体积大、肉眼可见，数量多，最关键的是其卵母细胞的成熟过程非常有意思，卵原细胞通过生长，进入减数分裂，通过G1，S期就停留在G2期，因为从G2期到M期，需要一种雌性激素，即需要孕酮的刺激，发现细胞就能顺利地进入M期，就完成第一次减数分裂，生成一个极体和一个次级卵母细胞，次级卵母细胞就停留在第二次减数分裂，停留在第二次减数分裂的中期（M期），要迈过M期，需
（人 M 期 HeLa 细胞与袋鼠 ( Ptk) G1、S、G2 期细胞融合诱导 PCC；发现染色质 提前凝聚，称为早熟染色体凝集，简称 PCC；G1 期为细单线状；S 期为粉末状；G2 期为双线染色体状）（提示: 在 M 期细胞中存在诱导 PCC 的因子!!!） M 期细胞与 G1（A）、S（B）和 G2（C）期细胞融合诱导早熟染色体凝缩（PCC） 2. 爪蟾卵子成熟过程； 用非洲爪蟾来做实验，仍然提出了 MPF 这个概念；为什么用非洲爪蟾的卵母细胞 来做这个实验，因为其卵母细胞体积大、肉眼可见，数量多，最关键的是其卵母细 胞的成熟过程非常有意思， 卵原细胞通过生长，进入减数分裂，通过 G1，S 期就停留在 G2 期，因为从 G2 期到 M 期，需要一种雌性激素，即需要孕酮的刺激，发现细胞就能顺利地进入 M 期，就完成第一次减数分裂，生成一个极体和一个次级卵母细胞，次级卵母细胞就 停留在第二次减数分裂，停留在第二次减数分裂的中期（M 期），要迈过 M 期，需
要精子细胞的受精过程，精子将其需要的营养物质给卵母细胞，则完成第二次减数分裂，生成一个极体，同时就生成了一个二倍体的受精卵。注：G2期的细胞核非常大，很明显；因为在G2期要合成大量的营养物质pr；此时这个体积很大的细胞核，称为生发泡（germinalvesicle，GV）；当生发泡已破裂，细胞就进入了M期；孕酮减数分裂I各级卵母细胞受精受精卵第一次卵裂减数分裂Ⅱ(Amphibian oocyte and earlyembryos offrogs;fertilization)（处于第六期的爪蟾卵母细胞(RD前期I)，具GV。此实验表明：激素（孕酮）诱导卵母细胞成熟：）3.MPF的发现；然后，把成熟卵母细胞（M期）的细胞质注射到间期卵母细胞里，人为地没有激素的作用下，看其生发泡是否会破裂，结果发现生发泡破裂（GVbrokendown）（实质是核被膜的破裂），细胞顺利从G2期进入M期。如果将间期细胞的细胞质注射进入间期细胞，则生发泡不会破裂；结果与分析：在成熟的卵细胞的细胞质中，必然有一种物质，可以诱导卵母细胞成熟，将这种物质称作促成熟因子，即MPF另外发现，在孕酮的作用下，细胞仍然能够顺利从G2期进入M期；在这个过程中还发现，当孕酮刺激后，G2期的细胞有蛋白质的合成，如果此时用蛋白质抑制剂抑制这个合成过程，即使用孕酮刺激，细胞也不会进入M期，这个结果提示：这个MPF很可能是一种蛋白质
要精子细胞的受精过程，精子将其需要的营养物质给卵母细胞，则完成第二次减数 分裂，生成一个极体，同时就生成了一个二倍体的受精卵。 注：G2 期的细胞核非常大，很明显；因为在 G2 期要合成大量的营养物质 pr；此时 这个体积很大的细胞核，称为生发泡（germinal vesicle, GV）；当生发泡已破裂，细 胞就进入了 M 期； （Amphibian oocyte and early embryos of frogs；fertilization） （处于第六期的爪蟾卵母细胞 (RD 前期 I)，具 GV。 此实验表明：激素（孕酮）诱导卵母细胞成熟；） 3. MPF 的发现； 然后，把成熟卵母细胞（M 期）的细胞质注射到间期卵母细胞里，人为地没有 激素的作用下，看其生发泡是否会破裂，结果发现生发泡破裂（GV broken down） （实质是核被膜的破裂），细胞顺利从 G2 期进入 M 期。 如果将间期细胞的细胞质注射进入间期细胞，则生发泡不会破裂； 结果与分析：在成熟的卵细胞的细胞质中，必然有一种物质，可以诱导卵母细 胞成熟，将这种物质称作促成熟因子，即 MPF. 另外发现，在孕酮的作用下，细胞仍然能够顺利从 G2 期进入 M 期；在这个过 程中还发现，当孕酮刺激后，G2 期的细胞有蛋白质的合成，如果此时用蛋白质抑制 剂抑制这个合成过程，即使用孕酮刺激，细胞也不会进入 M 期；这个结果提示：这 个 MPF 很可能是一种蛋白质
INJECTCYTOPLASMINJECTCYTOPLASMspindleeasilyFROMM-PHASEFROMINTERPHASEdetectedatCELLCELLcell surfacenucleusVTOOCYTEISOOCYTEDRIVENINTOREMAINSMPHASEING2PHASE(A)(B)（注射实验表明：在成熟卵细胞的细胞质中，含有诱导卵母细胞成熟的因子，称做MPF。)(MasuiandMarkert'sexperiments(J.Exp.Zool.177:142,1971)What's the role of hormone?Trigger protein synthesis补充：有学者研究MPF活性与细胞周期之间的有一定的关系。1979,MPFactivityundergoes dramatin fluctuationsincleavingeggs thatcorrelatewithchanges inthecellcycle.MitosisMitosisMitosisInterphaseInterphaseInterphaseMPFactivityHighLow那其中的原因是什么呢，还是不知道。前面第一批学者，用细胞融合提出促有丝分裂因子的概念，第二批学者，用爪蟾卵母细胞成熟过程提出了促成熟因子的概念，那么第三批学者有哪些进展呢？(1)Nurse found cdc2Inthemid-197Osasapostdoc studyingthefissionyeast裂殖酵母S.pombe稷酒Dividebeforetheyhadreachedfullsize:Mutants-wee:Weel，wee2（获得的温度敏感型的突变株：例如20多度的时候它可以生长，当升高温度到40度时，就不生长了)The wee2 gene was later renamed cell division cycle 2(CDC2)研究发现，当突变株的酵母细胞长的不是足够大的情况下（与野生型相比），就开始分裂增殖，因此就将其称为wee突变，Weel，wee2；后来发现wee2基因，恰好跟细胞增殖的
（注射实验表明：在成熟卵细胞的细胞质中，含有诱导卵母细胞成熟的因子，称做 MPF。）（Masui and Markert’s experiments(J. Exp. Zool. 177:142,1971) What’s the role of hormone? Trigger protein synthesis 补充：有学者研究 MPF 活性与细胞周期之间的有一定的关系。 1979，MPF activity undergoes dramatin fluctuations in cleaving eggs that correlate with changes in the cell cycle. 那其中的原因是什么呢，还是不知道。前面第一批学者，用细胞融合提出促有丝分裂因 子的概念，第二批学者，用爪蟾卵母细胞成熟过程提出了促成熟因子的概念，那么第三 批学者有哪些进展呢？ ⑴Nurse found cdc2 In the mid-1970s as a postdoc studying the fission yeast 裂殖酵母 S.pombe 稷酒 Divide before they had reached full size:Mutants-wee: Wee1, wee2（获得的温度 敏感型的突变株；例如 20 多度的时候它可以生长，当升高温度到 40 度时，就不生长 了） The wee2 gene was later renamed cell division cycle 2(CDC2) 研究发现，当突变株的酵母细胞长的不是足够大的情况下（与野生型相比），就开始分裂 增殖，因此就将其称为 wee 突变，Wee1, wee2；后来发现 wee2 基因，恰好跟细胞增殖的
大小有关系，后来将其重新命名为细胞分裂周期2基因，celldivisioncycle2，简称CDC2.cdc2Dcde2Normal（如果将cdc2过表达，则发现，酵母细胞进行分裂增殖，而且比正常细胞明显小很多：如果将cdc2基因缺失，发现酵母已经长到正常的二倍大小了，但是居然刚刚进入分裂增殖）（结果分析：酵母从间期进入M期的时间明显发生改变）后来发现cdc2encodesaproteinkinasewith34KDwhoseactivityisrequiredforcellstoenterMphase(p34cde2)，它是细胞进入M期所必须的。Nobel knighi,SinPaul Nunwe(2)Hartwellfoundcdc28In 1982, Nurse and his colleagues found that CDC2 was identical in function to CDC288from也与buddingyeast芽殖酵母，S.cerevisiae啤酒，麦酒在芽殖酵母中有一个基因是CDC28，细胞增殖有关系，也能让酵母细胞从G2期进入M期，与cdc2是同源的，也是促进细胞周期运转的一个激酶
大小有关系，后来将其重新命名为细胞分裂周期 2 基因，cell division cycle 2，简称 CDC2. (如果将 cdc2 过表达，则发现，酵母细胞进行分裂增殖，而且比正常细胞明显小很多；如 果将 cdc2 基因缺失，发现酵母已经长到正常的二倍大小了，但是居然刚刚进入分裂增殖) （结果分析：酵母从间期进入 M 期的时间明显发生改变） 后来发现 cdc2 encodes a protein kinase with 34KD whose activity is required for cells to enter M phase(p34cdc2)，它是细胞进入 M 期所必须的。 ⑵Hartwell found cdc28 In 1982, Nurse and his colleagues found that CDC2 was identical in function to CDC28 from budding yeast 芽殖酵母, S. cerevisiae 啤酒,麦酒;在芽殖酵母中有一个基因是 CDC28，也与 细胞增殖有关系，也能让酵母细胞从 G2 期进入 M 期，与 cdc2 是同源的，也是促进细胞 周期运转的一个激酶
Fother ef the cell ayclLeeHodellTransformwithplasmid libraryof wild-typecdc28mS,cerevisiaeDNAcellsTransformedgrownGene Xcdc28tcellsat25"Cgrownat35*CGeneYNo colonyformationCDsolateplasmidCells in colonyatvarious cell-cyclestaoes（cdc28如何分离？获得了一些温度敏感突变株；分离相关功能的基因：提取野生型酵母的RNA→反转录成cDNA（complementary）→重组到载体上→构建cDNA文库→将重组载体转染突变型的酵母细胞，如果重组的基因对突变型的酵母细胞没有修复作用，则不能长出克隆，如果能长出克隆，说明此基因与酵母增殖有关则可以分离、测序；(3)TimHuntfoundcyclinin1983When thegel wasdeveloped onFriday 23 July 1982,Ifoundthat thestrongest band early on suddenly got very much weaker at about thetimewhen the eggs were about todivide intwo.Thiswas astunning,startingdiscovery."用海胆卵细胞为材料，受精以后，用35s标记的一个氨基酸作为蛋白质合成的前体，与海胆的受精卵孵育，不同时间点取样，电泳，进行放射性显影，结果发现，原来
（cdc28 如何分离？获得了一些温度敏感突变株；分离相关功能的基因：提取野生型酵母 的 RNA→反转录成 cDNA（complementary）→重组到载体上→构建 cDNA 文库→将重组载体 转染突变型的酵母细胞，如果重组的基因对突变型的酵母细胞没有修复作用，则不能长出 克隆，如果能长出克隆，说明此基因与酵母增殖有关则可以分离、测序； ⑶Tim Hunt found cyclin in 1983 When the gel was developed on Friday 23 July 1982, I found that the strongest band early on suddenly got very much weaker at about the time when the eggs were about to divide in two. This was a stunning, starting discovery.” 用海胆卵细胞为材料，受精以后，用 35S 标记的一个氨基酸作为蛋白质合成的前 体，与海胆的受精卵孵育，不同时间点取样，电泳，进行放射性显影，结果发现，原来
有些亮度较强的带，在某些时间点变弱了，说明卵裂过程中的蛋白质是周期性的出现与消失，因此就成这种蛋白为周期蛋白（cyclin）35S-Met:Fertilizedeggs日From Timand hiscolleagues16min60min80min120irterphasemitosisioterphasemitosiRAPCyelinAcyclin8ribonucleotidereductase(MPF随Cyclin浓度变化而变化））ribonucleotidereductase核（糖核）苷酸还原酶(cyclin:in sea urchin eggs that is destroyed at each cleavage division)(EvansT,RosenthalET,YoungblomJetal.Cyclin:aproteinspecifiedbymaternal mRNAin sea urchin eggs that is destroyed at eachcleavagedivision.Cell,1983,33(2):389-96.)
有些亮度较强的带，在某些时间点变弱了，说明卵裂过程中的蛋白质是周期性的出现与 消失，因此就成这种蛋白为周期蛋白（cyclin） (MPF 随 Cyclin 浓度变化而变化))ribonucleotide reductase 核(糖核)苷酸还原 酶 (cyclin:in sea urchin eggs that is destroyed at each cleavage division) (Evans T, Rosenthal E T, Youngblom J et al. Cyclin: a protein specified by maternal mRNA in sea urchin eggs that is destroyed at each cleavage division. Cell, 1983, 33(2): 389-96.)
TimHunt(4)What istherelationshipbetweencyclins orcdc2andMPF?MPFpurification:1988(Xenopusegg);MPF=32kD+45kD;MPFhasproteinkinaseactivity以非洲爪蟾卵细胞为材料，分离纯化MPF，发现MPF是一个复合体，有两个蛋白质组成，一个亚基是32kD，另一个亚基是45kD，还发现MPF具有蛋白激酶活性。但是与cdc2和cyclin是什么关系，还是不清楚。后来，用cdc2抗体，能够与cdc2结合在一起，当与MPF孵育后，发现cdc2抗体也能与32kD的亚基结合在一起，说明cdc2与32KD的亚基使同源物；用同样的方法，也验证了cyclinB与45KD的亚基是同源物；结果分析：MPF是一个二聚体，其中一个亚基是激酶，另一个亚基是周期蛋白如果将体细胞的细胞质取一些注射到卵母细胞的细胞质中，发现卵母细胞仍能够从间期进入M期。4.MPF是一种使多种底物蛋白磷酸化的蛋白激酶；由M期Cyclin-Cdk（Cyclin-dependentproteinkinase）形成的复合物。MPF=(CDK1=p34cde2)+cyclinB
⑷What is the relationship between cyclins or cdc2 and MPF? MPF purification: 1988(Xenopus egg); MPF=32kD+45kD; MPF has protein kinase activity. 以非洲爪蟾卵细胞为材料，分离纯化 MPF，发现 MPF 是一个复合体，有两个蛋白质组成， 一个亚基是 32kD，另一个亚基是 45kD，还发现 MPF 具有蛋白激酶活性。但是与 cdc2 和 cyclin 是什么关系，还是不清楚。 后来，用 cdc2 抗体，能够与 cdc2 结合在一起，当与 MPF 孵育后，发现 cdc2 抗体也能与 32kD 的亚基结合在一起，说明 cdc2 与 32KD 的亚基使同源物；用同样的方法，也验证了 cyclin B 与 45KD 的亚基是同源物； 结果分析：MPF 是一个二聚体，其中一个亚基是激酶，另一个亚基是周期蛋白 如果将体细胞的细胞质取一些注射到卵母细胞的细胞质中，发现卵母细胞仍能够从间期进 入 M 期。 4.MPF 是一种使多种底物蛋白磷酸化的蛋白激酶；由 M 期 Cyclin-Cdk (Cyclindependent protein kinase) 形成的复合物。 MPF = (CDK1 = p34cdc2) + cyclinB