《细胞生物学》教案（第22次课2学时）一、授课题目第十三章程序性细胞死亡与细胞衰老（ProgrammedCell Death and Cell aging)二、教学目的和要求1.掌握细胞衰老,细胞凋亡的概念及基本特征；2.掌握细胞调亡的基因调控机制；3.了解细胞衰老的学说；4.了解研究细胞衰老和死亡的意义三、教学重点和难点教学重点：影响细胞凋亡的因素教学难点：细胞凋亡的机理四、主要参考资料五、教学过程
《细胞生物学》教案 （第 22 次课 2 学时） 一、授课题目 第十三章 程序性细胞死亡与细胞衰老（Programmed Cell Death and Cell aging） 二、教学目的和要求 1.掌握细胞衰老,细胞凋亡的概念及基本特征; 2.掌握细胞凋亡的基因调控机制; 3.了解细胞衰老的学说; 4.了解研究细胞衰老和死亡的意义. 三、教学重点和难点 教学重点：影响细胞凋亡的因素 教学难点：细胞凋亡的机理 四、主要参考资料 五、教学过程
衰老+机体结构细胞增殖细胞分化细胞测亡AA细胞信号转导N染色体（DNA与蛋白质的相互作用）第一节程序性细胞死亡细胞死亡：生命现象不可逆的停止。Three ways of animal cell death:Apoptosis:细胞调亡（希腊意思是droppingoff像花瓣或树叶落下）；Necrosis:细胞坏死（希腊意思是makedeath使之死亡）：Autophagy：细胞自噬细胞死亡的鉴定：中性红和台盼蓝染色I细胞凋亡(Apoptosis)一、细胞调亡的概念及其生物学意义概念：细胞在一定的生理或病理条件下，是一个由基因决定的主动结束生命的过程。，所以也常常被称为程序性细胞死亡（programmedcelldeath,PCD）。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。（Interchangeablywith“programmed celldeath:Thecellsactivatean intracellulardeathprogram and killthemselves in a controlled way1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞的溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死，这些细胞体积收缩、染色质凝集从其周围的组织中脱落并被吞噬，机体无炎症反应。1972年kerr等三位科学家首次提出了细胞调亡的概念，宣告了对细胞调亡的真正探索的开始，在此之前，关于胚胎发育生物学、免疫系统的研究，肝细胞死亡的研究都为这一概念的提出奠定了基础。1
1 第一节 程序性细胞死亡 细胞死亡：生命现象不可逆的停止。 Three ways of animal cell death: Apoptosis:细胞凋亡（希腊意思是 dropping off 像花瓣或树叶落下）； Necrosis:细胞坏死（希腊意思是 make death 使之死亡）； Autophagy:细胞自噬 细胞死亡的鉴定：中性红和台盼蓝染色 I 细胞凋亡(Apoptosis) 一、细胞凋亡的概念及其生物学意义 概念：细胞在一定的生理或病理条件下，是一个由基因决定的主动结束生命的过程。，所 以也常常被称为程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）。凋亡细胞将被吞噬细胞 吞噬。（Interchangeably with “programmed cell death”: The cells activate an intracellular death program and kill themselves in a controlled way. 1965 年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散 在的死亡细胞的溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死，这些细胞体积收缩、染色质凝 集从其周围的组织中脱落并被吞噬，机体无炎症反应。 1972 年 kerr 等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡的真正探 索的开始，在此之前，关于胚胎发育生物学、免疫系统的研究，肝细胞死亡的研究都为这 一概念的提出奠定了基础
1986年，Horvitz研究线虫突变体，使细胞凋广概念在基因水平上阐述。2002年获诺贝尔生理学医学奖。细胞凋亡指细胞在发育的一定阶段出现正常的自然死亡，它与细胞的病理死亡有根本的区别。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞调亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程：细胞发生调亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，对于这种生物学观察，借用希腊语apoptosis来表示，意思是像树叶或花的自然调落，可译为细胞调亡。a正常工细胞杂交瘤细胞b凋亡细胞（扫描电镜）凋亡细胞（透射电镜）左，正常胸腺细胞；右，凋亡胸腺细胞
2 1986 年，Horvitz 研究线虫突变体，使细胞凋亡概念在基因水平上阐述。2002 年获诺 贝尔生理学医学奖。 细胞凋亡指细胞在发育的一定阶段出现正常的自然死亡，它与细胞的病理死亡有根本 的区别。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉 及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现 象，而是更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程；细胞发生凋亡时，就像树叶或 花的自然凋落一样，对于这种生物学观察，借用希腊语 apoptosis 来表示，意思是像树叶 或花的自然凋落，可译为细胞凋亡
二、细胞调亡的形态学和生物化学特征(Morphologicalandbiochemicalcharacteristicsofapoptosis)（一）细胞凋亡与坏死(necrosis)二者的主要区别是，细胞调亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体（apoptoticbodies），调亡小体则为邻近的细胞所吞噬。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡细胞的内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎症反应。相反，在细胞坏死时，细胞质膜发生渗漏，细胞内容物，包括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段，释放到胞外，导致炎症反应；（小结：坏死和凋亡在形态学和生物化学上有着明显的差别：坏死是意外性、被动性的死亡，而调亡则是在胚胎发育过程中程序控制的死亡）细胞凋亡细胞坏死细胞变圆，与周围细胞脱开细胞外形不规则变化核染色质凝集溶酶体破坏细胞膜内陷细胞膜破裂胞浆外溢细胞分为一个小体被周围细胞吞噬引起周围炎症反应3
3 二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征(Morphological and biochemical characteristics of apoptosis) （一）细胞凋亡与坏死(necrosis) 二者的主要区别是，细胞凋亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器， 然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体（apoptotic bodies），凋亡小体则为邻近的细胞所吞 噬。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡细胞的内容物不会逸散到胞外环境中 去，因而不引发炎症反应。相反，在细胞坏死时，细胞质膜发生渗漏，细胞内容物，包括 膨大和破碎的细胞器以及染色质片段，释放到胞外，导致炎症反应；（小结：坏死和凋亡 在形态学和生物化学上有着明显的差别；坏死是意外性、被动性的死亡，而凋亡则是在胚 胎发育过程中程序控制的死亡） 细胞凋亡 细胞坏死 细胞变圆，与周围细胞脱开 细胞外形不规则变化 核染色质凝集 溶酶体破坏 细胞膜内陷 细胞膜破裂 细胞分为一个小体 胞浆外溢 被周围细胞吞噬 引起周围炎症反应
细胞凋亡和细胞坏死的区别区别点细胞凋亡细胞坏死起因生理或病理性病理性变化或剧烈损伤范围单个散在细胞大片组织或成群细胞破损细胞膜完整，形成凋亡小体固缩，DNA片段化细胞核弥漫性降解染色质呈絮状凝聚在核膜下呈半月状线粒体自身吞噬肿胀细胞体积固缩变小肿胀变大凋亡小体有，被相邻细胞或巨噬细胞无，细胞自溶，残余碎片被巨噬吞噬细胞吞噬基因组DNA有控降解，电泳图谱呈梯状随机降解，电泳图谱呈涂抹状基因活动由基因调控无基因调控常见缺少自吞噬有无蛋白质合成（二）细胞凋亡的形态学特征1.程序性死亡细胞的形态结构变化（1）凋亡的起始(innitiation）：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整：线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合：染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布。（Chromosomecondensation，cellbodyshrink）（2）调亡小体的形成（调亡小体（apoptoticbody）是细胞调亡过程中断裂的大小不等的DNA或染色质片段与细胞其它内含物一起被反折的细胞质膜包裹在细胞表面产生许多泡状或芽状突起，然后逐渐分离，形成的单个圆形小体。）(Blebbingand Nucleusandcytoplasmfragment-Apoptoticbodies)（3）吞噬：凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化(Phagocytosed）4
4 （二）细胞凋亡的形态学特征 1. 程序性死亡细胞的形态结构变化 （1）凋亡的起始(innitiation)：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触 的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离， 内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形 态，沿着核膜分布。(Chromosome condensation, cell body shrink) （2）凋亡小体的形成（凋亡小体（apoptotic body）是细胞凋亡过程中断裂的 大小不等的 DNA 或染色质片段与细胞其它内含物一起被反折的细胞质膜包裹， 在细胞表面产生许多泡状或芽状突起，然后逐渐分离，形成的单个圆形小体。） (Blebbing and Nucleus and cytoplasm fragment-Apoptotic bodies) （3）吞噬：凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化(Phagocytosed)
调亡小体吞噬细胞BAMild convolutionNuclearfragmentationChromatinApoptoticPhagocyticcompactionandBlebbingbodysegregationcellCell fragmentationCondensationofcytoplasmPhagocytosis(a)
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(Morphological features during the programmedcell death)((1)Initiation: the disappearance of the cell surface structure such as microvilli, the loss of cellcontaction, the mild convolution of the ER with plasm, the cytoskeleton collapse, thedisassembles of the nuclear envelope and chromatin compaction and segregation,(2)Formationof theapoptoticbodies:nuclear chromatinbreak up intofragments,thecell surfaceblebs and the cell breaks up intomembrane-enclosed fragments called apoptoticbodies,(3)Engulf:owingtothe loss of contaction withtheneighboringcell,theapoptoticbodieswillquickly be engulfed by neighboringcell ormacrophages beforetheir content to be spilled out)The typical feature of the programmed cell death:The neat death without content spilling, Nodamaging inflammatory response; ATP-depending cell self-killing,3.细胞调亡的生化特征1细胞凋亡的主要特征是形成大小为180～200bp特征性的DNAladders一发生核小体间断裂。2凋亡细胞tTG（组织转谷氨酰胺酶tissueTransglutaminase）积累并达到较高水平。tTG催化细胞内蛋白质交联，聚合，有助于保持调亡小体的完整性，防止有害物质渗漏。一tTG活性依赖于Ca2十，生活细胞内Ca2十浓度低，故其活性低：调亡起始时，Ca2十浓度上升，从而活性升高。一tTG催化细胞内蛋白质交联，聚合，有助于保持调亡小体的完整性，防止有害物质渗漏。（二）细胞调亡的检测1.形态学观测（morphologicalobservance）：（1)染色法：（staining）台盼蓝（trypanblue）：活细胞排斥，但可使死细胞着色；DAP1：是常用的一种与DNA结合的荧光染料，用DAP1染色借助荧光显微镜，可以观察到细胞核的形态变化；姬姆萨（Giemsa）：可以使染色质着色，便于在普通光学显微镜下观察到染色质固缩、凋亡小体的形成等调亡过程。透射和扫描电镜观察：可观察调亡细胞的形态、结构变化，如染色质固缩、调亡小体的形成、细胞发泡等现象。6
6 (Morphological features during the programmed cell death) (⑴Initiation: the disappearance of the cell surface structure such as microvilli, the loss of cell contaction, the mild convolution of the ER with plasm, the cytoskeleton collapse, the disassembles of the nuclear envelope and chromatin compaction and segregation; ⑵Formation of the apoptotic bodies: nuclear chromatin break up into fragments, the cell surface blebs and the cell breaks up into membrane-enclosed fragments called apoptotic bodies; ⑶Engulf:owing to the loss of contaction with the neighboring cell, the apoptotic bodies will quickly be engulfed by neighboring cell or macrophages before their content to be spilled out) The typical feature of the programmed cell death: The neat death without content spilling; No damaging inflammatory response; ATP-depending cell self-killing; 3. 细胞凋亡的生化特征 1 细胞凋亡的主要特征是形成大小为 180～200bp 特征性的 DNA ladders—发生核小体间 断裂。 2 凋亡细胞 tTG（组织转谷氨酰胺酶 tissue Transglutaminase）积累并达到较高水平。tTG 催化细胞内蛋白质交联，聚合，有助于保持凋亡小体的完整性，防止有害物质滲漏。 －tTG 活性依赖于 Ca2＋，生活细胞内 Ca2＋浓度低，故其活性低；凋亡起始时， Ca2＋ 浓度上升，从而活性升高。 －tTG 催化细胞内蛋白质交联，聚合，有助于保持凋亡小体的完整性，防止有害物质滲漏。 （二）细胞凋亡的检测 1.形态学观测（morphological observance）： ⑴染色法:（staining） 台盼蓝（trypan blue）:活细胞排斥，但可使死细胞着色； DAP1：是常用的一种与 DNA 结合的荧光染料，用 DAP1 染色借助荧光显微镜，可以观察 到细胞核的形态变化； 姬姆萨（Giemsa）：可以使染色质着色，便于在普通光学显微镜下观察到染色质固缩、凋 亡小体的形成等凋亡过程。 透射和扫描电镜观察：可观察凋亡细胞的形态、结构变化，如染色质固缩、凋亡小体的形 成、细胞发泡等现象
A,NormalcellB.Apoptosis:Apoptoticbodies（正常和调亡的T细胞杂交瘤细胞的扫描电镜照片）DAP1染色显示调亡细胞的染色质凝集B■A：正常细胞核B：调亡细胞核(2)DNA电泳(DNAelectrophoresis)：DNA片段就呈现出梯状条带即调亡细胞的DNA由于在核小体间发生断裂，产生200bp及其整倍数的片段，经琼脂糖凝胶电泳呈现出的梯状条带
7 (正常和凋亡的 T 细胞杂交瘤细胞的扫描电镜照片) ⑵DNA 电泳(DNA electrophoresis)：DNA 片段就呈现出梯状条带 即凋亡细胞的 DNA 由于在核小体间发生断裂，产生 200bp 及其整倍数的片段， 经琼脂糖凝胶电泳呈现出的梯状条带
细胞色素c诱的凋亡细胞DNA电泳图1.细胞色素c诱导0广款用h招明范在-2kb格小体所2.细胞色素c诱导1h-1kb3.细胞色素c诱导2h500bp细胞色素c诱导34h-200bp细胞色素c诱导45.h6.阴性对鼠7.Marker(180~200bpDNAladder,Accumulationof tTG,PSflip-flop;180~200bpDNAladderAccumulationoftTG,PSflip-flop;ApoptosisinducedbyCytoC;Lane1. 0h; 2. 1h; 3.2h; 4.3h; 5.4h; 6.Control; 7.Marker)(Endonuclease cleaves the chromosomal DNA into fragments of distinctive size; becausethe cleavages occur in the linker regions between nucleosomes, the fragments separate intoa characteristic ladder pattern when analyzed bygel eletrophoresis)(0,1,3,6,12小时)（3)TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法针对DNA分子中断裂缺口中的3OH进行原位标记，凋亡细胞的核DNA中产生的3OH末端，可帮助荧光素进行原位标记，并用荧光显微镜进行观察。8
8 （180~200bp DNA ladder, Accumulation of tTG, PS flip-flop；180~200bp DNA ladder, Accumulation of tTG, PS flip-flop；Apoptosis induced by Cyto C； Lane 1．0 h；2．1 h；3．2 h；4．3 h；5．4 h；6．Control；7．Marker） （Endonuclease cleaves the chromosomal DNA into fragments of distinctive size; because the cleavages occur in the linker regions between nucleosomes, the fragments separate into a characteristic ladder pattern when analyzed by gel eletrophoresis） (0,1,3,6,12 小时) ⑶TUNEL 测定法，即 DNA 断裂的原位末端标记法 针对 DNA 分子中断裂缺口中的 3’OH 进行原位标记，凋亡细胞的核 DNA 中产生的 3’ OH 末端，可帮助荧光素进行原位标记，并用荧光显微镜进行观察
248a-16sCon16s左：正常16体节期的斑马鱼胚胎在发育过程中有少量细胞发生调亡；右：突变体的中枢神经细胞发生大量调亡（图为鸡的组织在某一发育过程中发生凋亡：原理：针对DNA分子中断裂缺口中的3'OH进行原位标记，凋亡细胞的核DNA中产生的3'OH末端，可帮助荧光素进行原位标记，并用荧光显微镜进行观察。）(4)彗星电泳法（cometassay）原理是将单个细胞最浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电泳，并用荧光染料染色，调亡细胞中的DNA降解片段，在电场中泳动速度较快，使细胞核呈现一种彗星式的图案，而正常的无DNA断裂的核在泳动时保持圆球形，这是一种快速简便的凋亡检测法。(5)流式细胞分析：与正常完整的二倍体细胞相比，调亡细胞DNA发生断裂和丢失，呈亚二倍体状态；采用9
9 （图为鸡的组织在某一发育过程中发生凋亡；原理：针对 DNA 分子中断裂缺口中的 3’OH 进行原位标记，凋亡细胞的核 DNA 中产生的 3’OH 末端，可帮助荧光素进行原位标记， 并用荧光显微镜进行观察。） ⑷彗星电泳法（comet assay） 原理是将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电 泳，并用荧光染料染色，凋亡细胞中的 DNA 降解片段，在电场中泳动速度较快，使细胞 核呈现一种彗星式的图案，而正常的无 DNA 断裂的核在泳动时保持圆球形，这是一种快 速简便的凋亡检测法。 ⑸流式细胞分析： 与正常完整的二倍体细胞相比，凋亡细胞 DNA 发生断裂和丢失，呈亚二倍体状态；采用