《细胞生物学》教案（第3次课2学时）第二章细胞生物学研究方法(Chapter 3. Techniques in Cell Biology）[教学要求]2.1知识目标1.对细胞生物学的研究手段和方法进行初步了解，对不同的研究方法和手段在细胞生物学研究中的应用有初步的认识；2.掌握光学显微镜的成像原理；3.通过实验课了解和掌握光学显微镜各部分的结构和功能，，并学习正确使用光学显微镜的方法及维护常识。2.2能力目标1.通过实际操作掌握普通光学显微镜的使用；2.通过实际操作掌握荧光显微镜的使用。2.3德育目标1.要研究一个细胞生物学的问题，首先要从全局给出一个基本的程序，引导学生考虑问题要细致、全面、严谨：2.整个过程需要查阅文献，分析总结，利用适合的仪器、技术等，才能得出可靠的实验数据，引导学生意识到查阅文献的重要性，各种技术学习的重要性。[教学重点]仪器方法的基本原理和基本应用[教学难点]电镜制样及分子杂交技术[教学时数] 2学时[主要内容]第二节细胞及其组分的分析方法[参考资料]翟中和。细胞生物学，第五版．北京：高等教育出版社，2020[教学内容]
《细胞生物学》教案 （第 3 次课 2 学时） 第二章细胞生物学研究方法 （Chapter 3. Techniques in Cell Biology） [教学要求] 2.1 知识目标 1. 对细胞生物学的研究手段和方法进行初步了解，对不同的研究方法和手段在细胞生物学 研究中的应用有初步的认识； 2. 掌握光学显微镜的成像原理； 3. 通过实验课了解和掌握光学显微镜各部分的结构和功能,，并学习正确使用光学显微镜的 方法及维护常识。 2.2 能力目标 1. 通过实际操作掌握普通光学显微镜的使用； 2. 通过实际操作掌握荧光显微镜的使用。 2.3 德育目标 1. 要研究一个细胞生物学的问题，首先要从全局给出一个基本的程序，引导学生考虑问题 要细致、全面、严谨； 2. 整个过程需要查阅文献，分析总结，利用适合的仪器、技术等，才能得出可靠的实验数 据，引导学生意识到查阅文献的重要性，各种技术学习的重要性。 [教学重点] 仪器方法的基本原理和基本应用 [教学难点] 电镜制样及分子杂交技术 [教学时数] 2 学时 [主要内容] 第二节 细胞及其组分的分析方法 [参考资料] 翟中和． 细胞生物学， 第五版．北京：高等教育出版社，2020． [教学内容]
一个细胞能不能被拆散，然后通过多重的分离，分析方法，来研究构成细胞的那些组分，这些组分包括各种细胞器，大的复合物（例如：蛋白质和核酸形成的核糖体：细胞中蛋白质转运过程当中设计的一些膜泡：细胞里的两类关键的生物大分子，蛋白质和核酸）。通过胞内组分的分析方法研究细胞分子水平上的一些基础性问题。第二节细胞组分的分析方法细胞成分分析和形态学观察相结合，可揭示生物大分子在细胞内的构建及功能。用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物原理：利用颗粒大小的不同：差速离心法；速度区带离心法；利用颗粒密度的不同：等密度离心法用途：离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体等细胞器，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10000-25000r/min的离心机称为高速离心机：转速超过25000r/min，离心力大于89Kg者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达80000r/min，离心力超过500Kg。沉降系数（sedimentationcoefficient）用离心法时，大分子沉降速度的量度，等于每单位离心场的速度。或s=v/の2r。s是沉降系数，の是离心转子的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。沉降系数以每单位重力的沉降速度表示，（thevelocityperunitforce）并且通常为1～200×10-13秒范围，10-13这个因子叫做沉降单位S，即1S=10-13秒.沉降系数越大在离心时候越先沉降。如血红蛋白的沉降系数约为4×10-13秒或4S。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间，核糖体及其亚基在30S和80S之间，多核糖体在100S以上。差速离心（Differencialcentrifugation）：在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器，根据颗粒沉降速度不同得以分离。01000 g20 000g8000g1150 000g10min20min1h3h细胞核细胞勺浆线粒体、溶酶体、微体、高尔基体、核糖体、大分子复合物过氧化物酶体囊泡或病毒用差速离心法分离细胞匀浆中的各种细胞组分
一个细胞能不能被拆散，然后通过多重的分离，分析方法，来研究构成细胞的那些组分，这些 组分包括各种细胞器，大的复合物（例如：蛋白质和核酸形成的核糖体； 细胞中蛋白质转运过程当 中设计的一些膜泡； 细胞里的两类关键的生物大分子，蛋白质和核酸）。通过胞内组分的分析方法 研究细胞分子水平上的一些基础性问题。 第二节 细胞组分的分析方法 细胞成分分析和形态学观察相结合，可揭示生物大分子在细胞内的构建及功能。 一、 用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 原理：利用颗粒大小的不同：差速离心法；速度区带离心法；利用颗粒密度的不同：等密 度离心法 用途：离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体等细胞器，以及各种大分 子基本手段。一般认为，转速为 10000-25000r/min 的离心机称为高速离心机；转速超过 25000r/min，离心力大于 89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达 80000r/min，离心力超过 500Kg。 沉 降系数（sedimentation coefficient）用离心法时，大分子沉降速度的量度，等于 每单位离心场的速度。或 s=v/ω2r。s 是沉降系数，ω 是离心转子的角速度（弧度/ 秒），r 是到旋转中心的距离，v 是沉降速度。沉降系数以每单位重力的沉降速度表 示，（the velocity per unit force）并且通常为 1～200×10-13 秒范围，10-13 这个因 子叫做沉降单位 S，即 1S=10-13 秒.沉降系数越大在离心时候越先沉降。如血红蛋 白的沉降系数约为 4×10-13 秒或 4S。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在 4S 和 40S 之间，核糖体及其亚基在 30S 和 80S 之间，多核糖体在 100S 以上。 差速离心（Differencial centrifugation）： 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器，根 据颗粒沉降速度不同得以分离。 用差速离心法分离细胞匀浆中的各种细胞组分
OCOEEDCINUEEC速度区带离心法：用于分离大小差别不显著的组分：（用蔗糖梯度液稳定沉淀的成分，防止对流的混合）样品离心e慢沉降组分燕糖密快沉降组分度梯度密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化，蔗糖和多聚蔗糖。用于精细组分或生物大分子的分离。利用多种方法使细胞崩解，形成细胞器和细胞组分的混合匀浆，再通过差速离心，即利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。差速离心与密度离心相结合可以达到精确的分离。细胞不同组分沉降率不同，主要依赖于它们的形状和大小，通常以沉降系数S来表示（沉降系数是指悬浮在密度较低的溶剂中的一种溶质大分子，在每单位离心场作用下的沉降速率）。等密度离心法：按细胞组分的浮力不同进行分离的方法。适用于大小、形态相似而密度不同的组分。常将样品通过高浓度的蔗糖或氯化的密度梯度沉降在达到与自身密度相等的位置就停滞不再向下沉降。此方法直接证明了DNA的不保留复制
速度区带离心法：用于分离大小差别不显著的组分；（用蔗糖梯度液稳定沉淀的成分，防 止对流的混合） 密度梯度离心： 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置 于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度 沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。 用于精细组分或生物大分子的分离。 利用多种方法使细胞崩解，形成细胞器和细胞组分的混合匀浆，再通过差速离心，即 利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。 差速离心与密度离心相结合可以达到精确的分离。 细胞不同组分沉降率不同，主要依赖于它们的形状和大小，通常以沉降系数 S 来表 示(沉降系数是指悬浮在密度较低的溶剂中的一种溶质大分子，在每单位离心场作用下的 沉降速率)。 等密度离心法：按细胞组分的浮力不同进行分离的方法。适用于大小、形态相似而密度 不同的组分。常将样品通过高浓度的蔗糖或氯化铯的密度梯度沉降在达到与自身密度相 等的位置就停滞不再向下沉降。此方法直接证明了 DNA 的不保留复制
NNAA格养手台R培子正二代AMDAE谢定代宝商性化装G图车保银型制的低养层析：1、纸层析（用滤纸；水的移动速度比乙醇大；）2、柱层析：使蛋白质混合液通过含有多孔固体基质的柱中，不同蛋白质与基质相互作用被不同程度的滞留，这样可在柱底将它们分别收集。常用方法：离子交换层析；凝胶过滤层析；亲和层析；
层析：1、纸层析 （用滤纸；水的移动速度比乙醇大；） 2、柱层析：使蛋白质混合液通过含有多孔固体基质的柱中，不同蛋白质与基质相互作 用被不同程度的滞留，这样可在柱底将它们分别收集。 常用方法：离子交换层析；凝胶过滤层析；亲和层析；
二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂质等到的显色方法原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。1.金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS（硫化钻）或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。2.偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。3.Schif反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。4.联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。5.普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。6.Formazane反应：显示脱氢酶。7.Nadi"反应：显示细胞色素氧化酶。8.脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。9.萌三酮反应：显示蛋白质。原位成分分析常利用一些显色剂与所检物质的特殊基团特异性结合的特征，通过染色反应的部位和颜色的深浅来断某种物质在细胞内的分布与含量。福尔根（Feulgen）反应可特异显示DNA的存在部位。PAS（高碘酸-希夫反应）反应可确定多糖的存在。四氧化钱可证明脂肪滴的存在。苏丹II和苏丹黑也常用于脂肪的鉴定。米伦反应及重氮反应等用来测定蛋白质。检测和定位酶的技术是基于细胞或组织切片与适宜底物共同孵育，通过一定方法使产物显示出来。例如检测碱性磷酸酶的格莫瑞方法。三、特异蛋白质抗原的定位与定性免疫荧光和免疫电镜是最常用的细胞内蛋白质定位技术。1、免疫荧光技术免疫荧光技术就是将免疫学方法与荧光标记技术相结合研究特异蛋白质抗原在细胞内分布的方法。根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，并标上标记荧光素，对抗原进行定位测定的技术。快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限直接免疫荧光标记技术：利用偶联荧光分子的抗体与细胞或细胞切片进行孵育，使抗体和相应抗原结合，在荧光显微镜下对抗原进行定位的技术。间接免疫荧光标记技术：即不带荧光标记的第一抗体与相应抗原孵育形成复合物后，再用荧光标记的第二抗体识别第一抗体，从而显示抗原所在位置
二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂质等到的显色方法 原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在 细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。 1. 金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或 酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成 CoS（硫化钴）或 PbS 有色沉 淀，而显示出酶活性。 2. 偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。 3. Schiff 反应：细胞中的醛基可使 Schiff 试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用于 显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen 反应）。 4. 联苯胺反应：过氧化酶分解 H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺 蓝，进而变成棕色化合物。 5. 普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。 6. Formazane 反应：显示脱氢酶。 7. “Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。 8. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 9. 茚三酮反应：显示蛋白质。 原位成分分析常利用一些显色剂与所检物质的特殊基团特异性结合的特征，通过染 色反应的部位和颜色的深浅来断某种物质在细胞内的分布与含量。 福尔根(Feulgen)反应可特异显示 DNA 的存在部位。 PAS（高碘酸-希夫反应）反应可确定多糖的存在。 四氧化锇 可证明脂肪滴的存在。苏 丹 Ⅲ和苏丹 黑也常用于脂肪的鉴定。 米伦反应及重氮反应等用来测定蛋白质。 检测和定位酶的技术是基于细胞或组织切片与适宜底物共同孵育，通过一定方法使 产物显示出来 。例如检测碱性磷酸酶的格莫瑞方法。 三、特异蛋白质抗原的定位与定性 免疫荧光和免疫电镜是最常用的细胞内蛋白质定位技术。 1、免疫荧光技术 免疫荧光技术就是将免疫学方法与荧光标记技术 相结合研究特异蛋白质抗原在细 胞内分布的方法。根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，并标上标记荧光素， 对抗原进行定位测定的技术。 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 直接免疫荧光标记技术：利用偶联荧光分子的抗体与细胞或细胞切片进行孵育，使抗体 和相应抗原结合，在荧光显微镜下对抗原进行定位的技术。 间接免疫荧光标记技术：即不带荧光标记的第一抗体与相应抗原孵育形成复合物后，再 用荧光标记的第二抗体识别第一抗体，从而显示抗原所在位置
荧光分子第二抗体抗体抗原AB（应用：包括直接荧光标记技术（将荧光素标记在相应的抗体（第一抗体）上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、易于操作，省时省力，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；特异性不强；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。）和间接免疫荧光标记技术（染色程序分为两步，第一步，用已知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原（待检标本）标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体（通常为荧光标记的对应二抗）。（即荧光素先和第二抗体偶联，再与第一抗体作用：优点是：敏感度高，特异性强，可购买不同的标记二抗：缺点是：操作比直接法复杂）如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的荧光标记的二抗就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定被检测抗原。）补充：纯化抗原A，免疫动物，从动物的抗血清里分离出抗体，抗原A的抗体称为一抗，一抗作为抗原，再去免疫动物（例如兔子），将兔子的抗血清分离，得到的是一抗的二抗；将二抗带上一个marker（可以是荧光素或可以用GFP与二抗做成融合蛋白），让二抗去找一抗结合，二抗带标记就可以观察。2、免疫电镜技术免疫电镜技术使特异蛋白的定位与超微结构结合起来，使抗原定位更准确。如蛋白分泌的研究胞内酶的研究；一些结构蛋白的研究。免疫铁蛋白技术：铁蛋白是含铁离子的蛋白质，在电镜下铁离子可显黑色；免疫酶标技术：辣根过氧化物酶（HRP）免疫胶体金技术：即金的水溶液，具有一般溶液的特性，用它与抗体标记后，经抗原抗体反应可定位抗原的存在。应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态：胞内酶的研究：膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等
（应用：包括直接荧光标记技术（将荧光素标记在相应的抗体（第一抗体）上，直接与相 应抗原反应。其优点是方法简便、易于操作，省时省力，非特异性荧光染色少。缺点是敏 感性偏低；特异性不强；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细 菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。）和间接免疫荧光 标记技术（染色程序分为两步，第一步，用已知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原 （待检标本）标本上，在湿盒中 37℃保温 30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除 去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗 IgG、IgM 抗体（通常为 荧光标记的对应二抗）。（即荧光素先和第二抗体偶联，再与第一抗体作用；优点是：敏 感度高，特异性强，可购买不同的标记二抗；缺点是：操作比直接法复杂） 如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的荧光标记的二抗就会和已结合抗原的抗体进一 步结合，从而可鉴定被检测抗原。 ） 补充：纯化抗原 A，免疫动物，从动物的抗血清里分离出抗体，抗原 A 的抗体称为一抗， 一抗作为抗原，再去免疫动物（例如兔子），将兔子的抗血清分离，得到的是一抗的二 抗；将二抗带上一个 marker（可以是荧光素或可以用 GFP 与二抗做成融合蛋白），让二 抗去找一抗结合，二抗带标记就可以观察。 2、免疫电镜技术 免疫电镜技术使特异蛋白的定位与超微结构结合起来，使抗原定位更准确。如蛋 白分泌的研究胞内酶的研究；一些结构蛋白的研究。 免疫铁蛋白技术：铁蛋白是含铁离子的蛋白质，在电镜下铁离子可显黑色； 免疫酶标技术：辣根过氧化物酶（HRP） 免疫胶体金技术 : 即金的水溶液，具有一般溶液的特性，用它与抗体标记后，经抗原抗 体反应可定位抗原的存在。 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的 定位与骨架蛋白的定位等
免疫铁蛋白电镜技术（铁蛋白分子量大，应用在膜上）细胞外表面胞质腔面张白A抗体胶体金抗原08P免疫胶体金电镜原位杂交技术的基本原理与应用（膀胱上皮细胞膜蛋白的分布：箭头所指)免疫胶体金电镜技术（胶体金分子量非常小，可穿透细胞膜，应用在溶酶体等）（金对电子的散射程度高，透射程度低，透射的越少，在荧光屏上看到的是一个亮点，这个亮点是个副片，起成正片的时候是一个黑点，就是金颗粒所在位置，即抗体所在位置，表示它找到了抗原结合）（用途：能观察抗原在细胞里的定位；细胞特殊蛋白质的定位）（过去用的是铁蛋白做标记，分辨率不如胶体金，因此胶体金技术代替了铁蛋白标记）
免疫铁蛋白电镜技术（铁蛋白分子量大，应用在膜上） 免疫胶体金电镜原位杂交技术的基本原理与应用（膀胱上皮细胞膜蛋白的分布：箭头所 指） 免疫胶体金电镜技术（胶体金分子量非常小，可穿透细胞膜，应用在溶酶体等）(金对 电子的散射程度高，透射程度低，透射的越少，在荧光屏上看到的是一个亮点，这个亮点 是个副片，起成正片的时候是一个黑点，就是金颗粒所在位置，即抗体所在位置，表示它 找到了抗原结合 )（用途：能观察抗原在细胞里的定位；细胞特殊蛋白质的定位）（过去 用的是铁蛋白做标记，分辨率不如胶体金，因此胶体金技术代替了铁蛋白标记）
免疫荧光显微镜技术ELISA：酶联免疫吸附试验（抗原-抗体一标记酶（辣根过氧化物酶）→酶加底物，催化底物，相应产物一→染色，看到杂交信号一酶标仪检测，定量分析）（用途：用试剂盒，血清学检测，生化指标检测，医院的临床检测用的比较多）（全自动酶免工作站）随堂练习透射或扫描电子显微镜不能用于观察活细胞，而相差显微镜或倒置相差显微镜可以用于观察活细胞（V)蛋白电泳(SDS-PAGE与免疫印迹反应(Western-Blot)：其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳（electrophoresis）：在含有蛋白质分子的溶液里加上电场，蛋白质就会按照它的静电荷、大小和形状，以一定的速度在电场中移动，这一技术叫电泳。ED2湖3聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺+N,N-亚甲双丙烯酰胺聚合而成（实验方案：提取蛋白质一→垂直版电泳SDS-PAGE一→凝胶转移到醋酸纤维或尼龙膜上，带被拷贝下来一洗掉背景一探针带上酶反应，加上酶的底物一酶催化底物变成产物→显色的方法表示产物，可知蛋白质在细胞中是否合成了））
免疫荧光显微镜技术 ELISA：酶联免疫吸附试验（抗原-抗体→标记酶（辣根过氧化物酶）→酶加底物，催化 底物，相应产物→染色，看到杂交信号→酶标仪检测，定量分析）（用途：用试剂盒，血 清学检测，生化指标检测，医院的临床检测用的比较多）（全自动酶免工作站） 随堂练习 透射或扫描电子显微镜不能用于观察活细胞，而相差显微镜或倒置相差显微镜可以用于 观察活细胞（√） 蛋白电泳(SDS-PAGE 与免疫印迹反应(Western-Blot)：其基本原理是通过特异性抗体对凝 胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特 定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）:电泳（electrophoresis）:在含有蛋白质分子的 溶液里加上电场，蛋白质就会按照它的静电荷、大小和形状，以一定的速度在电场中移 动，这一技术叫电泳。 聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺+N,N’-亚甲双丙烯酰胺聚合而成 （实验方案：提取蛋白质→垂直版电泳 SDS-PAGE→凝胶转移到醋酸纤维或尼龙膜 上，带被拷贝下来→洗掉背景→探针带上酶反应，加上酶的底物→酶催化底物变成产物 →显色的方法表示产物，可知蛋白质在细胞中是否合成了））
双向电泳：单向SDS-PAGE电泳分辨率差，只能分开50左右种的蛋白。双向电泳可分辨1000种以上的蛋白质，一般为2000-15000种。步骤：1、等电聚焦电泳：2、在垂直于第一次电泳的方向上进行SDS-PAGE电泳o四、细胞内特异核酸的定位与定性1、原位杂交技术用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或细胞中的位置的方法。光镜水平的原位杂交技术（同位素标记或荧光素标记的探针）电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）
双向电泳：单向 SDS-PAGE 电泳分辨率差，只能分开 50 左右种的蛋白。双向电泳可分 辨 1000 种以上的蛋白质，一般为 2000-15000 种。 步骤：1、等电聚焦电泳：2、在垂直于第一次电泳的方向上进行 SDS-PAGE 电泳 四、细胞内特异核酸的定位与定性 1、原位杂交技术 用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或细胞中的位置的 方法。 光镜水平的原位杂交技术（同位素标记或荧光素标记的探针） 电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）
用原位杂交技术显示Z13基因在受精后1d的斑马鱼胚胎的体节、眼和松果体中的表达（箭头所指）（FISH荧光原位杂交：标记的探针是同位素，即用同位素标记的探针来研究某一个特殊的蛋白，让探针去找，观察探针显示的部位，来决定探针相结合的靶蛋白；生物素标记：研究某些生物大分子的分布）2、Southern技术（了解）蛋白样品经电泳后，与DNA探针进行吸附，与DNA有亲合作用的蛋白带被显示出来。把凝胶电泳分离开的DNA片段，通过扩散或电泳转移到硝酸纤维素膜上，做成一个凝胶的复制品，这个过程叫做印迹。将硝酸纤维素膜与带有放射性标记的探针杂交，通过放射自显影就可以辨认出与探针互补的特殊的核苷酸序列。利用标记的DNA探针检测某一特定的DNA序列的方法称为Southernblot，检测特定RNA序列的方法称为Northernblot。PCR技术和DNA测序方法LabeledDNAorRNAprobesNitrocetaneAutoradiogramElectrophoretic geONA fragment0.5 kgWeightsClstsStackoPopes+NTONmembranBecte4urnete利用放射性标记技术研究生物大分子在细胞内的合成动态原理：利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究：应用：实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究步骤：掺入、制片、敷胶、曝光、显影、镜检其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。还可实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用，对样品中放射性标记物进行定性与定位测定。（放射性核素在蜕变过程中发出带电粒子可使感光材料
用原位杂交技术显示 Z13 基因在受精后 1d 的斑马鱼胚胎的体节、眼和松果体中的表达 （箭头所指） （FISH 荧光原位杂交：标记的探针是同位素，即用同位素标记的探针来研究某一个特殊 的蛋白，让探针去找，观察探针显示的部位，来决定探针相结合的靶蛋白；生物素标记： 研究某些生物大分子的分布） 2、Southern 技术（了解） 蛋白样品经电泳后，与 DNA 探针进行吸附，与 DNA 有亲合作用的蛋白带被显示出 来。 把凝胶电泳分离开的 DNA 片段，通过扩散或电泳转移到硝酸纤维素膜上，做成一个 凝胶的复制品，这个过程叫做印迹。将硝酸纤维素膜与带有放射性标记的探针杂交，通 过放射自显影就可以辨认出与探针互补的特殊的核苷酸序列。 利用标记的 DNA 探针检测某一特定的 DNA 序列的方法称为 Southern blot，检测特 定 RNA 序列的方法称为 Northern blot。 PCR 技术和 DNA 测序方法 利用放射性标记技术 研究生物大分子在细胞内的合成动态 原理：利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子 进行定性、定位与半定量研究； 应用：实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究 步骤：掺入、制片、敷胶、曝光、显影、镜检 其原理是将放射性同位素（如 14C 和 3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时 间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放 射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本 中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜 下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。 还可实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用，对样品中放射 性标记物进行定性与定位测定。（放射性核素在蜕变过程中发出带电粒子可使感光材料