第八章基因工程菌培养 概述 基因工程菌生产的产品主要有二类,蛋白 质和非蛋白质。 基因操作: ●敲除或插入基因片段、增强启动子 一代谢工程 ●基因插入载体,转化工程菌
第八章 基因工程菌培养 一、概述 基因工程菌生产的产品主要有二类，蛋白 质和非蛋白质。 基因操作： ⚫敲除或插入基因片段、增强 启动子— —代谢工程 ⚫基因插入载体，转化工程菌
非蛋白质产物大多可以通过代谢工程,改 造细胞的一些基因,如在细胞中插入编码 酶的DNA,产生新的途径或增强某一途径, 从而得到新的化合物或增加产量。 蛋白类产物大多是外源基因片段整合到载 体(如质粒)上,然后转入宿主菌,表达 外源蛋白。 现代基因工程发酵的蛋白质产物主要是这 种方法构建重组菌
蛋白类产物大多是外源基因片段整合到载 体（如质粒）上，然后转入宿主菌，表达 外源蛋白。 现代基因工程发酵的蛋白质产物主要是这 种方法构建重组菌 非蛋白质产物大多可以通过代谢工程，改 造细胞的一些基因，如在细胞中插入编码 酶的DNA，产生新的途径或增强某一途径， 从而得到新的化合物或增加产量
产物/产品 宿主菌 菌体密度[gDCW几 培养基 产物产量 半乳糖苷辞 JM103 合成 4600U/OD 人a干扰素 AM-7 4870 合成 L 蛋白Ap半乳糖苷蹿 KA197 合成 19.2g兀L Min抗体 Rv308 合成 1.04gL 蛋白Ap半乳糖苷酶 TGI 95.5 合成 285×105U几 3异丙基苹果酸脱氢醇 C6 合成 16.00u/g 聚羟基丁酸 XL LI-Blue 101.4 复合 812g 聚羟基丁酸 XLl-Blue 175,4 半合成 6.5g几 聚羟基丁酸 124.6 合成 34.3g 苯基丙氨酸 AT2471 合成 46g/L 大肠杆菌氨酸合成辞 LFO3301 102 合成 16×10U/g 人骨形成蛋白2A YK537 ODm=5 半合成 2.78gL 人白介素31 YK537 OD60=53 半合成 3.3g兀L 人肿瘤坏死因子2 YK537 OD60=120 半合成 6g/L 人肿瘤坏死因子(31 YK537 OD60=60 半合成 5.l2g几L y干扰素( DHSa 104 合成 1.1x10°U几 细胞因子、疫苗、酶
细胞因子、疫苗、酶
产品最主要的用于疾病的诊断和治疗, 此外还有用于畜牧业、食品或工业用的生 物催化剂。 产品特点:要求高纯度。如果不纯,病人 可能产生的强的免疫反应或副作用这对人 是灾难性的。 有的蛋白转译后还要进行修饰,如糖基 化、磷酸化后才有活性。 附加值高。治疗蛋白最主要的是保证产 品的质量和安全,降低成本并不重要
产品最主要的用于疾病的诊断和治疗， 此外还有用于畜牧业、食品或工业用的生 物催化剂。 产品特点：要求高纯度。如果不纯，病人 可能产生的强的免疫反应或副作用这对人 是灾难性的。 有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基 化、磷酸化后才有活性。 附加值高。治疗蛋白最主要的是保证产 品的质量和安全，降低成本并不重要
宿主—载体系统 构建基因工程菌,必须选择宿主和表达系统 要求:翻译后的修饰要简单 如果用于食品要考虑宿主菌要求安全, 列入FDA表中 常用的宿主系统有:大肠杆菌 G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞
二、宿主-载体系统 构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统 要求：翻译后的修饰要简单 如果用于食品要考虑宿主菌要求安全， 列入FDA表中 常用的宿主系统有：大肠杆菌 G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞
1、大肠杆菌 如果产品翻译后不需要修饰,最普遍选用大肠 杆菌作为宿主 优点: ●人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解 得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因 操作; 大肠杆菌有相当高的生长速率,并能长到高 细胞浓度(50g/); ●大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上
1、大肠杆菌 如果产品翻译后不需要修饰，最普遍选用大肠 杆菌作为宿主。 优点： ⚫人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解 得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因 操作； ⚫大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高 细胞浓度（50g/l）； ⚫大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上
大肠杆菌作为宿主的主要问题是 大肠杆菌分泌( secretion)的蛋白通常在 细胞内,当这些蛋白达到高浓度时,会被 水解或形成不溶的包含体。包含体中的蛋 白是不折叠的,不折叠的蛋白没有生物活 性,必须重新溶解并使它复性 ●大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响 应。热冲击调节子的一种响应是增加蛋白 水解酶的活性。在一些情况下,细胞内蛋 白水解酶使蛋白的降解速率几乎等于产生 的速率
大肠杆菌作为宿主的主要问题是 ⚫大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在 细胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被 水解或形成不溶的包含体。包含体中的蛋 白是不折叠的，不折叠的蛋白没有生物活 性，必须重新溶解并使它复性。 ⚫大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响 应。热冲击调节子的一种响应是增加蛋白 水解酶的活性。在一些情况下，细胞内蛋 白水解酶使蛋白的降解速率几乎等于产生 的速率
2、G细菌 枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种,它是 G菌,它没有外膜,并且能把蛋白分泌 ( excretion)到胞外。它的这一性质对生 产非常有吸引力。 枯草杆菌有许多问题妨碍它在商业上的应 用。主要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶, 会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建 比大肠杆菌困难,质粒稳定性也比较差, 所以在使用上有较大的限制
2、G +细菌 枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是 G+菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌 （excretion）到胞外。它的这一性质对生 产非常有吸引力。 枯草杆菌有许多问题妨碍它在商业上的应 用。主要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶， 会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建 比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差， 所以在使用上有较大的限制
3、低等真核细胞 酵母菌酿酒酵母是第一个被人利用的生物 现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等 优点 ●生长快最大生长速率是大肠杆菌的25% ●个体大酵母比最大的细菌大,容易从发 酵液中回收。 ●有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力 缺点酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难, 外源蛋白分泌到胞外也有限 只能简单糖基化。 当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译 后修饰时,要用动物细胞组织培养来达到
3、低等真核细胞 酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物 现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等 优点 ⚫生长快 最大生长速率是大肠杆菌的25% ⚫个体大 酵母比最大的细菌大，容易从发 酵液中回收。 ⚫有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。 缺点 酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难， 外源蛋白分泌到胞外也有限。 只能简单糖基化。 当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译 后修饰时，要用动物细胞组织培养来达到
4、哺乳动物细胞 哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排 列,而且所有转译后处理(修饰)与在整 个动物中相同,在某种情况下可能转译后 修饰有些不同,但它可提供最接近于天然 副本的产物,此外多数产物可以分泌到胞 外 但动物细胞生长缓慢,培养基价格昂贵 蛋白表达水平较低。用于重组DNA生产蛋 白的最常用的宿主是cHo(中国仓鼠卵巢 细胞)
4、哺乳动物细胞 哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排 列，而且所有转译后处理（修饰）与在整 个动物中相同，在某种情况下可能转译后 修饰有些不同，但它可提供最接近于天然 副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞 外。 但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵， 蛋白表达水平较低。用于重组DNA 生产蛋 白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢 细胞）