种质导航 栏目编释王苏龙Emi1:angag.Ccn电话010-5150356 种高效快速鉴定蔬菜品种 和检测杂交种纯度的新方法 本烂日持激主持郑晓康 农业部蔬菜种子质量监督检 李丽郑晓店 测试中心主任 品种鉴定实际上是一个连续过 烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)水平板半 剂、变性剂和助溶剂，它能断裂分子 程，从品种繁育到品种推广、品种整 干申泳技术讲行$SR指纹图谱的分 内和分子间的氢键，使分子去折叠。 殖、采收和品种贸易等，鉴定贯穿了 折，并成功地将其应用于品种整定 而且SDS分子结合到核酸分子上 每一个环节。随着（植物新品种保护 和纯度检测。 可以除电泳中电荷对核酸分子的 条例》等有关育种者权利保护法规 、材料和方法 响，使其得到恒定的荷/质比。 的颁布实施，涉及作物品种权争议 1.供试材料 控制凝胶电泳条件时，温度控制调 和育种者权益保护的事例逐年增加， 供试材料为育种家提供的大白 节在4一15℃，避免了50℃的高温， 植物新品种保护问题更加突出。如 菜样品44份，包括大白菜杂交种和 因此，电泳系统可以采用水平板半干 何保护品种繁有者、生产者的知识 适合不同气候条件的地方品种， 技术，电泳槽不必需要缓冲液相而 产权利益？如何使种子使用者减 2,和万因 得更简便，水平电泳槽具有冷却板 使用假劣种子所造成的损失？寻求 原理：选用的介质是聚丙烯酚 冷却效果好，凝胶在冷却板上得到充 品种真实性鉴定的有效分子标记技 胺凝胶，和琼脂糖凝胶相比，缩小了 分的冷却，使得可以在胶上加高电 术体系成为备受关注的方法 凝胶孔径，对各种大小的DNA核甘 ,以缩短电泳时间(80min)和提 险室综合对比各种实验方法，摸索 酸片段都具有分子筛的效应，达到 高分辨率（见图1）。 建立了一种新的分子标记的电泳方 了高分辨率的效果。使用十二烷基 方法凝胶分上下两层，上层为 法一 一应用十二烷基硫酸钠一聚丙 硫酸钠(SDS)代替尿素作为去污 浓缩胶，胶的浓度T为6%，交联度 M1234567891011121311516171819202 32457风4 23335337940414244M 图1： 一对SSR引物对44份大白菜样品应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝 (SDS-PAGE)半干电泳技术进行DNA扩增片断电泳分离得到的SSR分子标记品 李丽，郑晓离，北京市农林科学院拔菜研究 种鉴定指纹图谱，M为分子量标准对照。 [装莫207234《拨菜)杂志一做足拨装经济文章 China Academic Joumal Electronic Publishing House.All rights reserved. http://www.cnki.net
2007/12 《蔬菜》杂志——做足蔬菜经济文章 Ve g e t a b l e s 34 本栏目特邀主持 郑晓鹰 农业部蔬菜种子质量监督检验 测试中心副主任 种质导航 栏目编辑：王敏 苏龙 E-mail:wangm@agri.ac.cn 电话：010-51503567 品种鉴定实际上是一个连续过 程，从品种繁育到品种推广、品种繁 殖、采收和品种贸易等，鉴定贯穿了 每一个环节。随着《植物新品种保护 条例》等有关育种者权利保护法规 的颁布实施，涉及作物品种权争议 和育种者权益保护的事例逐年增加， 植物新品种保护问题更加突出。如 何保护品种繁育者、生产者的知识 产权利益？如何使种子使用者减小 使用假劣种子所造成的损失？寻求 品种真实性鉴定的有效分子标记技 术体系成为备受关注的方法。本实 验室综合对比各种实验方法，摸索 建立了一种新的分子标记的电泳方 法——应用十二烷基硫酸钠 - 聚丙 烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）水平板半 干电泳技术进行 SSR 指纹图谱的分 析，并成功地将其应用于品种鉴定 和纯度检测。 一、材料和方法 1. 供试材料 供试材料为育种家提供的大白 菜样品44份，包括大白菜杂交种和 适合不同气候条件的地方品种。 2. 原理和方法 原理：选用的介质是聚丙烯酰 胺凝胶，和琼脂糖凝胶相比，缩小了 凝胶孔径，对各种大小的 DNA 核甘 酸片段都具有分子筛的效应，达到 了高分辨率的效果。使用十二烷基 硫酸钠（SDS）代替尿素作为去污 剂、变性剂和助溶剂，它能断裂分子 内和分子间的氢键，使分子去折叠。 而且 SDS 分子结合到核酸分子上， 可以排除电泳中电荷对核酸分子的 影响，使其得到恒定的荷/质比。在 控制凝胶电泳条件时，温度控制调 节在4～15 ℃，避免了50 ℃的高温， 因此，电泳系统可以采用水平板半干 技术。电泳槽不必需要缓冲液槽而变 得更简便，水平电泳槽具有冷却板， 冷却效果好，凝胶在冷却板上得到充 分的冷却，使得可以在凝胶上加高电 压，以缩短电泳时间（80 min）和提 高分辨率（见图 1）。 方法：凝胶分上下两层，上层为 浓缩胶，胶的浓度T为6 %，交联度 一种高效快速鉴定蔬菜品种 和检测杂交种纯度的新方法 李 丽，郑晓鹰，北京市农林科学院蔬菜研究 中心 ，100097 图 1： 一对 SSR 引物对 44 份大白菜样品应用十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶 （SDS-PAGE）半干电泳技术进行 DNA 扩增片断电泳分离得到的 SSR 分子标记品 种鉴定指纹图谱，M 为分子量标准对照。 李 丽 郑晓鹰
八种质导航 栏目编辑王敏苏龙E-ai1:angnBagr1.ac.cn电话010-51503567 Vegetables C为2.6%，凝胶缓冲液为1o1的 大白菜品种和检测杂交种的纯度 Tris-HC1缓冲液，p6.8:下层为分 但这些还远远不够，蔬菜品种繁多 “多抗富韭六号” 离胶，胶的浓度T为12.5%，交联 并且各类蔬菜的新品种不断有出， 度C为2%，凝胶缓冲液为1mo1的 因此蛋白质同工酶技术的应用仍然 韭菜 Tris-C1缓冲液，pH8.&凝胶中十 受到局限，满足不了广泛而迫切的 烷基疏酸钠(SS)的浓度为0.1% 多抗型韭菜新品种 要求 用滤纸条代替凝胶条，滤纸中所吸 2.分子标记 轰动全国出口国外 附的阳极缓冲液为0.45ol的Tris DNA分子标记是近缘种或品种 在河南省扶沟县蔬菜研究所培有成功 acetate摆冲被.nH8.4.含0.20】 鉴定的发展方向，DNA是直接的遗 的Tricine和O.5SDs 滤纸中所吸 传物质 “蛋白质同工酶受到 附的阴极缓冲液为0.08ol的Tris- 境和植物发育阶段影响的限制，可 河南省扶沟县蔬菜研究所 acetate缓冲液，p6.4,含0.8ml的 以解决蛋白质同工酶电泳无法解决 Tricine和0.25%SDS。载样缓冲液 的间题。但在众多的DNA分子标记 中含10umol的Tris,1 中如何选择，应依材料而定，本实验 EDTA的二钠盐，0.05多 二甲苯蓝 室在利用分子标记鉴定蔬品种方 0.04%溴酚蓝，用醋酸调节至7.5。 而也做出了研究成果。如利用 变性缓冲液中含94.05%甲酰胺， ALP.SRAP和SSR标记整别黄瓜 0.05%一甲苯蓝.0.04%浪酚蓝 甜（辣）椒、大白草和甘蓝搜培品种 菜游叶蝇，非螟。对灰霉病、疫病抗性 DA完成了扩增的样品和变性缓冲 的亲缘关系： 利用RAPD标记鉴定 液以1：1的体积比混合在94℃条件 番茄、大白菜和甜（辣）杂交种纯度 时新生的2一3片心叶仍能以每天0.7cm 下变性5min。取2ul经变性的DNA 等等。十字花科的蔬菜类在SSR, 扩增样品混合于5u1载样缓冲液后， SRAP,AFP指纹图谱中表现出较高 进行凝胶点样，每个样品点样 品种上市以来，由于其良好的抗寒、抗球 ul. 的多态。SSR标记是十 整个电冰过程温度控制在1 ℃，调 在全国各地得以推 现以成为全 节电压为600V,电流50mA, 功率 理想的标记，因为它具有高度的重 露地、保护地种植更新换代的理组新品 30W:当浪酚蓝指示线跑讨浓缩歌 复性、简单的带型，具有共显性等特 线培要点：适时早播。当日平均 后，增大电洁为100mA功率0 点。SSR标记在种间、属间具有保守 温稳定在12℃时即可播种。在河南、河 大约80min完成电泳过程。染色采用 ·套特异引物可在不同种 银染。电泳仪器采用的是安玛西亚公 品种间使用。本方法基于实验室 可播种。播流足底肥 精细整地。可 可Multiphor II电泳槽和电泳仪。 年的工作基础和多种成熟的核酸指 二、分析和讨论 纹技术体系，应用于十二烷基硫酸 1由)露地种植播量1~1.5kg,保护地 1.生化标记 -聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE) 种搭量34kg 本实验室在利用生化标记进行 干电泳技术分析大白菜$SR指纹 品种鉴定和杂交种纯度检测方面有 图谱，建立起了一种简单（鉴定过程 着十几年的基础，例如应用苹果酸 简单易行)、特定（重复性极高）、快 司经销通讯地址：河南省扶沟县商贸 股氢酶检测番茄杂交种纯度：酯醇 束（鉴定时间只需一星期）、成本低 和酸性磷酸酯酶同工酶电泳技术松 鉴定一份样品只需300 400元) -62357046464300 0394-6235704 测绿菜花和西瓜杂交种纯度：利用 新方法。通过建立标准样品的清晰 十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶 可鉴定的标准指纹图谱，意在寻求 南省衣行扶沟县支行 559 8208732475 (SDS-PAGE)电泳技术检测甜（辣） 利用SSR指纹图谱进行商品种子 椒和西瓜杂交种纯度：利用过氧化 定的有效途径。圆 物酶、酯酶、磷酸葡萄糖变位酶鉴定 网址：m.hnfsjc..com 《蔬菜》杂志 -做足蔬菜经济文章3520712装美 1994-009 China Academie Joumal Electronie Publishing House.All rights reserved. http://www.cnki.ne
《蔬菜》杂志——做足蔬菜经济文章 2007/12 Ve g e t a b l e s 35 种质导航 栏目编辑：王敏 苏龙 E-mail:wangm@agri.ac.cn 电话：010-51503567 C为2.6 %，凝胶缓冲液为1 mol的 Tris-HCl缓冲液，pH6.8 ；下层为分 离胶，胶的浓度 T 为12.5 %，交联 度C为2 %，凝胶缓冲液为1 mol的 Tris-HCl缓冲液，pH8.8；凝胶中十二 烷基硫酸钠（SDS）的浓度为0.1 %。 用滤纸条代替凝胶条，滤纸中所吸 附的阳极缓冲液为0.45 mol的Trisacetate缓冲液，pH 8.4，含0.2 mol 的Tricine和0.55 %SDS；滤纸中所吸 附的阴极缓冲液为0.08 mol的Trisacetate缓冲液，pH 6.4，含0.8 mol的 Tricine和0.25 %SDS。载样缓冲液 中含 10 μmol 的 Tris，1 μmol 的 EDTA的二钠盐，0.05 %二甲苯蓝， 0.04 %溴酚蓝，用醋酸调节pH至7.5。 变性缓冲液中含 94.05 % 甲酰胺， 0.05 % 二甲苯蓝，0.04 %溴酚蓝。 DNA 完成了扩增的样品和变性缓冲 液以1∶1的体积比混合在94 ℃条件 下变性5 min。取2 ul经变性的DNA 扩增样品混合于5 ul载样缓冲液后， 进行凝胶点样，每个样品点样7 ul。 整个电泳过程温度控制在15 ℃，调 节电压为600 V，电流50 mA，功率 30 W；当溴酚蓝指示线跑过浓缩胶 后，增大电流为100 mA，功率60 W， 大约80 min完成电泳过程。染色采用 银染。电泳仪器采用的是安玛西亚公 司Multiphor II电泳槽和电泳仪。 二、分析和讨论 1. 生化标记 本实验室在利用生化标记进行 品种鉴定和杂交种纯度检测方面有 着十几年的基础，例如应用苹果酸 脱氢酶检测番茄杂交种纯度；酯酶 和酸性磷酸酯酶同工酶电泳技术检 测绿菜花和西瓜杂交种纯度；利用 十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶 （SDS-PAGE）电泳技术检测甜（辣） 椒和西瓜杂交种纯度；利用过氧化 物酶、酯酶、磷酸葡萄糖变位酶鉴定 大白菜品种和检测杂交种的纯度。 但这些还远远不够，蔬菜品种繁多， 并且各类蔬菜的新品种不断育出， 因此蛋白质同工酶技术的应用仍然 受到局限，满足不了广泛而迫切的 要求。 2. 分子标记 DNA 分子标记是近缘种或品种 鉴定的发展方向，DNA 是直接的遗 传物质，克服了蛋白质同工酶受环 境和植物发育阶段影响的限制，可 以解决蛋白质同工酶电泳无法解决 的问题。但在众多的 DNA 分子标记 中如何选择，应依材料而定，本实验 室在利用分子标记鉴定蔬菜品种方 面也做出了研究成果。如利用 AFLP， SRAP 和 SSR标记鉴别黄瓜、 甜（辣）椒、大白菜和甘蓝栽培品种 的亲缘关系；利用 RAPD 标记鉴定 番茄、大白菜和甜（辣）杂交种纯度 等等。十字花科的蔬菜类在 SSR, SRAP, AFLP指纹图谱中表现出较高 的多态。SSR 标记是十字花科蔬菜 品种鉴定和杂交种纯度检测上最为 理想的标记，因为它具有高度的重 复性、简单的带型，具有共显性等特 点。SSR标记在种间、属间具有保守 性，同一套特异引物可在不同种和 品种间使用。本方法基于实验室多 年的工作基础和多种成熟的核酸指 纹技术体系，应用于十二烷基硫酸 钠 - 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE） 半干电泳技术分析大白菜 SSR 指纹 图谱，建立起了一种简单（鉴定过程 简单易行）、稳定（重复性极高）、快 速（鉴定时间只需一星期）、成本低 （鉴定一份样品只需300～400元）的 新方法。通过建立标准样品的清晰 可鉴定的标准指纹图谱，意在寻求 利用 SSR 指纹图谱进行商品种子鉴 定的有效途径。 特征特性：多抗富韭六号是利用新 品种平韭六号韭菜为原种进行种内杂交， 通过杂交混合选择培育而成的最新多抗品 种，经大面积种植表明：多抗富韭六号是 保护地种植的韭菜中理想品种。该品种叶 色深绿，鲜嫩，辛辣味浓，叶宽 1.2 cm， 最宽叶可达 2.5 cm ，单株重达 50 g 左 右，品质好，耐热，较耐干旱，尤其抗韭 菜潜叶蝇，韭螟蛾，对灰霉病、疫病抗性 强，无干尖，无病斑现象，该品种抗寒性 极强，冬季不休眠，在日平均气温3 ～7 ℃ 时新生的 2～3 片心叶仍能以每天 0.7 cm 的速度生长，每年可收割 7～8 刀，年每 667 m2（１亩）产鲜韭1.4万 kg左右。该 品种上市以来，由于其良好的抗寒、抗病 性和优质高产的特性，深受广大韭农的喜 爱，在全国各地得以推广，现以成为全国 露地、保护地种植更新换代的理想新品 种。 栽培要点：适时早播，当日平均气 温稳定在 12 ℃时即可播种。在河南、河 北、山东省可3 月下旬至4月底为最佳适 播期。中原地带及以南地区夏、秋、冬均 可播种。播前施足底肥，精细整地，可直 播或育苗移栽，播后覆层一指厚的细土。 出苗期间始终保持土壤湿润。每 667 m2 （1亩）露地种植播量1～1.5 kg，保护地 种植播量 3～4kg。 公司经销通讯地址：河南省扶沟县商贸城 种子市场 61 号 电话：0394 — 6235704 6464300 传真：0394-6235704 邮编：461300 开户行：河南省农行扶沟县支行 帐号：95599 8208 73247 86610 收款人（全称）：刘富生 E － mail:Pdsjcyzc@126.com 网址：www.hnfsjc.com 河南省扶沟县蔬菜研究所 “多抗富韭六号” 韭菜 多抗型韭菜新品种 轰动全国 出口国外 在河南省扶沟县蔬菜研究所培育成功 蔬