杂交玉米、水稻和辣椒种子 品种真实性和纯度的室内快速鉴定 严敏，王晓峰 (华南农业大学生命科学学院，广东广州510642) 摘要：利用超薄等电聚焦电泳技术对杂交玉米水稻和辣椒的种子进行品种真实性和纯度鉴定，发现所测杂交 玉米组合89、辣椒组合13的F,种子都同时具有父、母本特征带，均为真实的杂交种子，所测杂交玉米粤优1 号和杂交水稻华优99的F,种子均不纯」 关键词：杂交玉米，杂交水稻：杂交辣椒：品种真实性：纯度整定 中图分类号：339.31 文献标识码：A 文章编号：1001-411X(2003)02.0006.03 种子的纯度和品种真实性是种子检验的重要内 玉米：取杂交组合89的F及其父母本种子各 容它不仅是种子质量的重要指标直接关系到作物 3粒单粒捣碎每粒加入800川氯化钠溶液(4 产量的高低和品质的好坏，而且也是申请作物新品 mo/L):随机选取杂交玉米粤优1号F种子200 种的重要指标.传统的鉴定方法主要是通过田间小 粒，单粒捣碎，按5/m加入蛋白质提取缓冲液 区种植来进行，它不仅费时、费力、成本高，而且受环 [1000mL蛋白质提取缓冲液含32.43g尿素，120L 境、气候因素影响较大川.种子蛋白质的超薄等电聚 乙二醇（化学纯）1 焦电泳技术(UltrathirLayer Ioelectric Focusing,简称 水稻：随机选取杂交水稻华优桂99F,种子200 为UEF)是由Radola2)发展起来并经国外一些种 粒，单粒粉碎，每粒加中=30%的2氯乙醇120 子检验室改进的一种非常实用的电泳技术.该法用 提取蛋白质 于检验种子纯度和品种真实性时，具有简便、快速、 以上材料在常温下提取1h后，10000r/min离 准确经济的特点，已被写入ISTA(International Seed 心5min上清液用于电泳点样 iation)种子检验规程p, 该法在胡椒4 音雪个水有海种季定上攻烟了领器东 1.2.2电泳按参考文献[7]的方法进行.所加两 性电解质(Seat)的pH范围：辣椒为pH2一9；玉 文运用这种方法在室内对几个杂交玉米、水稻和辣米水稻为pH6~9. 椒组合的品种真实性和种子的纯度进行了鉴定 2结果与分析 1材料与方法 利用电泳技术判定F种子是否为真正的杂交 1.1供试材料 种子，主要是看它是否同时具有父本、母本的特征蛋 供试材料由广东省农业科学院经济作物研究所 白质带如有则为点实：的杂交种子·若只具有母末 (杂交玉米粤优1号,种子)、广州市蔬菜所（辣椒杂 特征带而无父本特征带 ,则为“假杂种”若既无父本 交组合13的F:及其亲本种子)、华南农业大学生 特征带又无母本特征带，则为品种混杂.从图1可看 命科学院叶绍文老师（玉米杂交组合89的F,及其 出，杂交辣椒组合13中，母本有2条特征带，分别 亲本种子)及华南农业大学开发公司种子种苗中心 为B1和MB2:父本有3条特征带，分别为 (杂交水稻华优桂99F种子)提供 B1MB2和MMB3:所测的4粒F,种子同时具有 1.2试验方法 父本、母本特征带B1、B2、B1、B2利 1.2.1蛋白质的提取辣椒：取杂交组合13的F,MB3,所以均为真实的杂交种子.从图2可看出杂 及其父母本种子各4粒，单粒磨碎，每粒加入中= 交玉米组合8⑨中母本且右】条特征带B父本 30%的2氯乙醇60L提取蛋白质 具有2条特征带MMB1和MB2,所测的3粒F,种 稿日期200m.09.0m 验项目广东省自学金0T男究生通4·男粒 :广东省教有厅自然科学基金资助项目(20068) e1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co..Lid All rights reserved
收稿日期 :2002 - 09 - 02 作者简介 :严 敏(1972 - ) ,男 ,硕士研究生. 通讯作者 :王晓峰(1964 - ) ,男 ,教授. 基金项目 :广东省自然科学基金资助项目(000590) ; 广东省教育厅自然科学基金资助项目(200068) 杂交玉米、水稻和辣椒种子 品种真实性和纯度的室内快速鉴定 严 敏 , 王晓峰 (华南农业大学 生命科学学院 ,广东 广州 510642) 摘要 :利用超薄等电聚焦电泳技术对杂交玉米、水稻和辣椒的 F1 种子进行品种真实性和纯度鉴定 ,发现所测杂交 玉米组合 8 ×9、辣椒组合 1 ×3 的 F1 种子都同时具有父、母本特征带 ,均为真实的杂交种子. 所测杂交玉米粤优 1 号和杂交水稻华优 99 的 F1 种子均不纯. 关键词 :杂交玉米 ; 杂交水稻 ; 杂交辣椒 ; 品种真实性 ; 纯度鉴定 中图分类号 :S339131 文献标识码 :A 文章编号 :1001 - 411X (2003) 02 - 0006 - 03 种子的纯度和品种真实性是种子检验的重要内 容 ,它不仅是种子质量的重要指标 ,直接关系到作物 产量的高低和品质的好坏 ,而且也是申请作物新品 种的重要指标. 传统的鉴定方法主要是通过田间小 区种植来进行 ,它不仅费时、费力、成本高 ,而且受环 境、气候因素影响较大[1 ] . 种子蛋白质的超薄等电聚 焦电泳技术 (Ultrathin2Layer Isoelectric Focusing , 简称 为 UTLIEF) 是由 Radola[2 ]发展起来并经国外一些种 子检验室改进的一种非常实用的电泳技术. 该法用 于检验种子纯度和品种真实性时 ,具有简便、快速、 准确、经济的特点 ,已被写入 ISTA ( International Seed Testing Association) 种子检验规程[3 ] . 该法在胡椒[4 ] 、 番茄[5 ] 、水稻[6 ]等品种鉴定上取得了较好的结果. 本 文运用这种方法在室内对几个杂交玉米、水稻和辣 椒组合的品种真实性和种子的纯度进行了鉴定. 1 材料与方法 111 供试材料 供试材料由广东省农业科学院经济作物研究所 (杂交玉米粤优 1 号 F1 种子) 、广州市蔬菜所(辣椒杂 交组合 1 ×3 的 F1 及其亲本种子) 、华南农业大学生 命科学院叶绍文老师(玉米杂交组合 8 ×9 的 F1 及其 亲本种子) 及华南农业大学开发公司种子种苗中心 (杂交水稻华优桂 99 F1 种子) 提供. 112 试验方法 11211 蛋白质的提取 辣椒 :取杂交组合 1 ×3 的 F1 及其父母本种子各 4 粒 ,单粒磨碎 ,每粒加入 φ = 30 % 的 22氯乙醇 60μL 提取蛋白质. 玉米 :取杂交组合 8 ×9 的 F1 及其父母本种子各 3 粒 ,单粒捣碎 ,每粒加入 800 μL 氯化钠溶液 ( 4 mmol/ L) ;随机选取杂交玉米粤优 1 号 F1 种子 200 粒 ,单粒捣碎 ,按 5 μL/ mg 加入蛋白质提取缓冲液 [1 000 mL 蛋白质提取缓冲液含 32143 g 尿素、120μL 乙二醇(化学纯) ]. 水稻 :随机选取杂交水稻华优桂 99 F1 种子 200 粒 , 单粒粉碎 ,每粒加 φ= 30 % 的 22氯乙醇 120μL 提取蛋白质. 以上材料在常温下提取 1 h 后 ,10 000 r/ min 离 心 5 min. 上清液用于电泳点样. 11212 电泳 按参考文献[7 ]的方法进行. 所加两 性电解质 (Servalyt) 的 pH 范围 :辣椒为 pH 2～9 ;玉 米、水稻为 pH 6～9. 2 结果与分析 利用电泳技术判定 F1 种子是否为真正的杂交 种子 ,主要是看它是否同时具有父本、母本的特征蛋 白质带 ,如有 ,则为真实的杂交种子 ;若只具有母本 特征带而无父本特征带 ,则为“假杂种”;若既无父本 特征带又无母本特征带 ,则为品种混杂. 从图 1 可看 出 ,杂交辣椒组合 1 ×3 中 ,母本有 2 条特征带 ,分别 为 FMB1 和 FMB2 ; 父 本 有 3 条 特 征 带 , 分 别 为 MMB1、MMB2 和 MMB3 ;所测的 4 粒 F1 种子同时具有 父本、母本特征带 FMB1、FMB2、MMB1、MMB2 和 MMB3 ,所以均为真实的杂交种子. 从图 2 可看出杂 交玉米组合 8 ×9 中 ,母本具有 1 条特征带 FMB ,父本 具有 2 条特征带MMB1 和MMB2 ,所测的 3 粒 F1 种子 第 24 卷 第 2 期 2003 年 4 月 华南农业大学学报(自然科学版) Journal of South China Agricultural University(Natural Science Edition) Vol. 24 , No. 2 Apr. 2003 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
第2期 严敏等：杂交玉米水稻和辣椒种子品种真实性和纯度的室内快速鉴定 7 同时具有父，母本的特征带B、MB1和MB2,因 此均为真实的杂交种子 MMBI- FMBI- MMB2- FMB2 MMB3一子里单第鞋里县写 箭头所指为其他品种的种子 B1AB2:母本特征带1和2：MB12和MB3:父本特任待图3杂交玉米粤优1号5种子蛋白质超薄等电聚焦电泳图 12和3 FMBI ,FMB marker band I and 2 Fig 3 图1 maize(cv.Yueyou 1) 电聚焦电泳图谱 seeds of hybnid capsicu FMB- MMB2 箭头所指为其他品种的种子 BB:母本特征带8B1MB2:父本特征带1和 。染交水华优种于蛋白质超等电聚焦电法 图洁 MRI NMB2-mle hind 1 and 2 Fig.4 U'ILIEF electrophoregram of proteins from F seeds of hybrid 图2杂交玉米组合89的斯及父母本种子蛋白质超薄等 nce(cv.Huayougui 99) 电聚焦电泳图谱 Fig.2 UILIEF clectrophoregram of proxteins fiom parental and 5 3 蛋白质是基因表达的直接产物，能够反映不同 有时在无法得到父母本种子的情况下，也可以 基因型之间的差异，区别不同的品种，从而可以用 通过观察F,种子蛋白质超薄等电聚焦电泳图谱的 鉴定杂交种子的品种直实性和纯度.本试验利用和 致性来鉴定杂交种 子的纯度。如果所测种子的纯 子蛋白质超薄等电聚焦电泳技术对杂交玉米、水程 度为100%.则它们的蛋白质带型应完全一致.如种 和辣椒种子进行品种真实性和纯度鉴定，取得了较 子不纯，则会出现不同的带型.从图3可看出有2粒 好的结果.超薄等电聚焦电泳技术是根据不同蛋白 种子的蛋白质带刑与大数种子的蛋白质带刑不 质具有不同的等电点的原理来区分各类蛋白质，具 同，可以初步判定为其他品种的种子 从图4可看出 有分辨率高的优点)，采用超薄等点聚焦电泳技术 有1粒种子的蛋白质带型与大多数种子的蛋白质带 从样品的制备到凝胶脱色只需约5h,因而半个工作 型不同，可以初步判定为其他品种的种子。据此，测 日就可以得到鉴定结果 由于采用水平平板电 定200粒（农作物种子检验规程中规定鉴定纯度时 操作简便，且可以同时点几十个样，加上凝胶超薄 所需要的种子数)种 后，发现杂交玉米粤优 所需药品很少所以成本较低因面该技术值得在 种子中有10粒的带型与其他种子不同，杂交水稻华 品种真实性和种子纯度鉴定上推厂 运用 优桂99下：种子中有22粒的带型与其他种子不同 得出杂交玉米粤优1号F,种子的纯度为95%杂交 参考文献 水稻华优桂99F,种子的纯度为89% C1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Dise Co..Lid All rights reserved
同时具有父、母本的特征带 FMB、MMB1 和 MMB2 ,因 此均为真实的杂交种子. FMB1、FMB2 :母本特征带 1 和 2 ;MMB1、MMB2 和 MMB3 :父本特征带 1、2 和 3 FMB1 ,FMB2 : female marker band 1 and 2 ; MMB1 ,MMB2 和 MMB3 :male marker band 1 ,2 and 3 图 1 杂交辣椒组合 1 ×3 的 F1 及父母本种子蛋白质超薄等 电聚焦电泳图谱 Fig. 1 UTLIEF electrophoregram of proteins from parental and F1 seeds of hybrid capsicum FMB :母本特征带 ;MMB1、MMB2 :父本特征带 1 和 2 FMB :female marker band ; MMB1 ,MMB2 :male marker band 1 and 2 图 2 杂交玉米组合 8 ×9 的 F1 及父母本种子蛋白质超薄等 电聚焦电泳图谱 Fig. 2 UTLIEF electrophoregram of proteins from parental and F1 seeds of hybrid maize 有时 ,在无法得到父母本种子的情况下 ,也可以 通过观察 F1 种子蛋白质超薄等电聚焦电泳图谱的 一致性来鉴定杂交种子的纯度. 如果所测种子的纯 度为 100 % ,则它们的蛋白质带型应完全一致 ,如种 子不纯 ,则会出现不同的带型. 从图 3 可看出有 2 粒 种子的蛋白质带型与大多数种子的蛋白质带型不 同 ,可以初步判定为其他品种的种子. 从图 4 可看出 有 1 粒种子的蛋白质带型与大多数种子的蛋白质带 型不同 ,可以初步判定为其他品种的种子. 据此 ,测 定 200 粒(农作物种子检验规程中规定鉴定纯度时 所需要的种子数) 种子后 ,发现杂交玉米粤优 1 号 F1 种子中有 10 粒的带型与其他种子不同 ,杂交水稻华 优桂 99 F1 种子中有 22 粒的带型与其他种子不同 , 得出杂交玉米粤优 1 号 F1 种子的纯度为 95 % ,杂交 水稻华优桂 99 F1 种子的纯度为 89 %. 箭头所指为其他品种的种子 Cultivars other than Yueyou 1 are indicated by ↑ 图 3 杂交玉米粤优 1 号 F1 种子蛋白质超薄等电聚焦电泳图 谱 Fig. 3 UTLIEF electrophoregram of proteins from F1 seeds of hybrid maize (cv. Yueyou 1) 箭头所指为其他品种的种子 Cultivar other than Huayougui 99 is indicated by ↑ 图 4 杂交水稻华优桂 99 F1 种子蛋白质超薄等电聚焦电泳 图谱 Fig. 4 UTLIEF electrophoregram of proteins from F1 seeds of hybrid rice (cv. Huayougui 99) 3 讨论 蛋白质是基因表达的直接产物 ,能够反映不同 基因型之间的差异 ,区别不同的品种 ,从而可以用以 鉴定杂交种子的品种真实性和纯度. 本试验利用种 子蛋白质超薄等电聚焦电泳技术对杂交玉米、水稻 和辣椒种子进行品种真实性和纯度鉴定 ,取得了较 好的结果. 超薄等电聚焦电泳技术是根据不同蛋白 质具有不同的等电点的原理来区分各类蛋白质 ,具 有分辨率高的优点[8 ] . 采用超薄等点聚焦电泳技术 , 从样品的制备到凝胶脱色只需约 5 h ,因而半个工作 日就可以得到鉴定结果[6 ] . 由于采用水平平板电泳 , 操作简便 ,且可以同时点几十个样 ,加上凝胶超薄 , 所需药品很少 ,所以成本较低. 因而 ,该技术值得在 品种真实性和种子纯度鉴定上推广运用. 参考文献 : [1 ] ROSTA K. Variety determination in rice ( Oryza sativa L) 第 2 期 严 敏等 :杂交玉米、水稻和辣椒种子品种真实性和纯度的室内快速鉴定 7 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
华南农业大学学报（自然科学板） 第24卷 p].Seed Science and Techmology,1975,3 (1):161- tion of tomato (Lveopericon esetento L)by ultrathirlaye 169. isoelectrie focusing of seed protein [J ]Seed Science and [RADCLA BJ.Ultrathirlayer isoelectric focusing in 50-100 Techrology,2000.28:201-213. m polyacrylamide gels on silanized glass plates or polyester [6]VANANGAMUDI K,PALANISAMYV,NATESAN P,ct al. films[J ]Hlectrophoresis.1980.1:43-56. Variety determination in riceexamination of the hulled grain xes[J].Seed U1.Seed Science and Technoloay 1988 16:457-464. 99,27. 333 [71 [4]LUCCHESEC.DNBLI G d ele Intemational Rice Re 37.47 [8】何忠效，张树政.电泳M.第2版.北京：科学出版社 [5]WANGXF,KNOBLAUCH R,LEISTN.Varictal discriminer 1999.59-104. Varietal Identification and Genetic Purity Testing of Hybrid Maize,Capsicum and Rice in Laboratory YAN Min,WANG Xiaorfeng (College of Life Science,South China Agric.Univ.Guanghou 510642,China AbstractUtrathilayer iselectric focusing of seed protein was used for varietal identification and genetic purity testing of hybrid maize,capsicum and rice.was found that the Fseeds of hybrid maizeand capsicum1 had both of the male and female marker bands from parental lines,and were considered to be genuine hybrids. hybrid maize(cv.Yueyou 1)and rice(cv.Huaguiyou 99)were found to be not genetically pure. Key maize hybrid rice hybrid capsicum varietal purity 【责任编辑柴焰】
[J ]. Seed Science and Technology , 1975 , 3 (1) : 161 - 169. [2 ] RADOLA B J . Ultrathin2layer isoelectric focusing in 50 - 100 μm polyacrylamide gels on silanized glass plates or polyester films[J ]. Electrophoresis , 1980 , 1 :43 - 56. [3 ] ISTA. International rules for seed testing2Annexes[J ]. Seed Science and Technology , 1999 , 27 , Supplement :1 - 333. [4 ] LUCCHESE C , DINELLI G, MIGGIANO A ,et al. Identifica2 tion of pepper ( Capsicum spp. ) cultivars by field and elec2 trophoresis tests[J ]. Seed Science and Technology ,1999 ,27 : 37 - 47. [ 5 ] WANG X F , KNOBLAUCH R , LEIST N. Varietal discrimina2 tion of tomato ( Lycopersicon esculentum L) by ultrathin2layer isoelectric focusing of seed protein [J ]. Seed Science and Technology , 2000 , 28 : 201 - 213. [6 ] VANANGAMUDI K, PALANISAMY V , NATESAN P , et al. Variety determination in rice2examination of the hulled grain [J ]. Seed Science and Technology , 1988 , 16 : 457 - 464. [7 ] WANG X F , KNOBLAUCH R , LEIST N. Identification of va2 rieties and testing of hybrid purity of rice by ultrathin2layer iso2 electric focusing of seed protein [J ]. International Rice Re2 search Notes , 2001 , 26(1) : 18 - 19. [8 ] 何忠效 ,张树政. 电泳[M]. 第 2 版. 北京 :科学出版社 , 1999. 59 - 104. Varietal Identification and Genetic Purity Testing of Hybrid Maize , Capsicum and Rice in Laboratory YAN Min , WANG Xiao2feng (College of Life Science , South China Agric. Univ. , Guangzhou 510642 , China) Abstract :Ultrathin2layer isoelectric focusing of seed protein was used for varietal identification and genetic purity testing of hybrid maize , capsicum and rice. It was found that the F1 seeds of hybrid maize 8 ×9 and capsicum 1 ×3 had both of the male and female marker bands from parental lines , and were considered to be genuine hybrids. However , F1 seeds of hybrid maize (cv. Yueyou 1) and rice (cv. Huaguiyou 99) were found to be not genetically pure. Key words :hybrid maize ; hybrid rice ; hybrid capsicum ; varietal identification ; genetic purity 【责任编辑 柴 焰】 8 华 南 农 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 第 24 卷 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved