发酵制药 子学习情境1.3 干扰素发酵
子学习情境1.3 干扰素发酵 发 酵 制 药
■ 基因工程菌株Pseudomonas putida VG84[pVG3]工程菌株应该具备假单胞杆 菌 宿主细胞的特征和生产于扰素的能力。基因工程菌的特性如下： 1、宿主细胞假单胞杆菌特性 (1)细胞形态。革兰阴性，可运动，有荚膜，无芽抱，杆状，长度为3~5m。 (2)菌落特征。在LB琼脂培养基上，30℃培养24h,其菌落直径为2.5~3.Omm, 灰绿色半透明状。菌落之间结构相同，具有黏稠性。 2、生化特性 不能将明胶、淀粉、聚B羟丁酸液化为可溶性单糖，不能利用反硝化作用进 成灾 系。 菌株为苏氨酸营养缺陷型，可以利用L-缬氨 酸、DL-精氨酸和L-苏氨酸作为碳源。 3、遗传特性 DNA中G和C的含量为63%。细胞中携带pVG3质粒，具有硫酸链霉素、盐酸 四环素和氨卡青霉素的抗性。 4、生产能力 ■ 具有生产干扰素-a2b的能力，其放射性免疫学效价不低于2.O×1O9UL。 LOGO
LOGO ▪ 基因工程菌株Pseudomonas putida VG84[pVG3]工程菌株应该具备假单胞杆 菌 ▪ 宿主细胞的特征和生产于扰素的能力。基因工程菌的特性如下： ▪ 1、宿主细胞假单胞杆菌特性 ▪ (1)细胞形态。革兰阴性，可运动，有荚膜，无芽抱，杆状，长度为3～5µm。 ▪ (2)菌落特征。在LB琼脂培养基上，30℃培养24h，其菌落直径为2.5～3.Omm， ▪ 灰绿色半透明状。菌落之间结构相同，具有黏稠性。 ▪ 2、生化特性 ▪ 不能将明胶、淀粉、聚-β-羟丁酸液化为可溶性单糖，不能利用反硝化作用进 行厌氧呼吸，能够合成荧光色素。菌株为苏氨酸营养缺陷型，可以利用L-缬氨 酸、DL-精氨酸和L-苏氨酸作为碳源。 ▪ 3、遗传特性 ▪ DNA中G和C的含量为63%。细胞中携带pVG3质粒，具有硫酸链霉素、盐酸 四环素和氨卡青霉素的抗性。 ▪ 4、生产能力 ▪ 具有生产干扰素- a 2b的能力，其放射性免疫学效价不低于2.O×lO9IU/L
任务1菌种库和工作菌种库的建立及保存 LOGO
LOGO 任务1 菌种库和工作菌种库的建立及保存
1、菌种库的建立、传代及保存 从原始菌种库出发，传代、扩增后，冻干保存，作为主代 菌种库(Master cell ·bank,MCB),主代菌种库不得进行选育工作。从主代菌种 库传代、扩增后，甘油管保存，作为工作菌种库Vorking cell bank,WCB)。工作种子库也可由上一代工作种子库传 出，但每次只限传三代。每批主代菌种库均进行划线LB琼 脂平板、涂片革兰氏染色、对抗生素的抗性、电镜检查、 生化反应、干扰素的表达量、表达的干扰素型别、质粒检 查的检定，合格后方可投产。 ·原始菌种库、主菌种库和工作菌种库于-70它以下温度保存。 LOGO
LOGO 1、菌种库的建立、传代及保存 ▪ 从原始菌种库出发，传代、扩增后，冻干保存，作为主代 菌种库(Master cell ▪ bank,MCB)，主代菌种库不得进行选育工作。从主代菌种 库传代、扩增后，甘油管保存，作为工作菌种库(Working cell bank,WCB)。工作种子库也可由上一代工作种子库传 出，但每次只限传三代。每批主代菌种库均进行划线LB琼 脂平板、涂片革兰氏染色、对抗生素的抗性、电镜检查、 生化反应、干扰素的表达量、表达的干扰素型别、质粒检 查的检定，合格后方可投产。 ▪ 原始菌种库、主菌种库和工作菌种库于-70它以下温度保存
2、工作菌种库的建立及保存 ()培养基制备。生产过程中使用的培养基均按一定工艺要 求配制。 ■（②）接种、转移及培养。取12支主代菌种库菌种接大摇瓶内 摇床培养， ·吸光值(OD值)为5.5±1.0。将已培养好的摇瓶种子液转移 至种子罐中，通人无菌空气，培养至吸光值符合放罐要求 (○D值为8.0士2.0)。种子罐培养结束后，无菌操作转移到 离心管中，离心5mmn,加新鲜菌种培养基，将菌体制成 菌悬液，并加入甘油使其浓度达到18%，分装于Ependorf 管中，每支(1.0±0.2)mL。 ■ (3)保存。分装完毕，于-20℃放置16~20h,在-70℃下可 保存3年。 LOGO
LOGO 2、工作菌种库的建立及保存 ▪ (1)培养基制备。生产过程中使用的培养基均按一定工艺要 求配制。 ▪ (2)接种、转移及培养。取12支主代菌种库菌种接大摇瓶内， 摇床培养，至 ▪ 吸光值(OD值)为5.5±1.0。将己培养好的摇瓶种子液转移 至种子罐中，通人无菌空气，培养至吸光值符合放罐要求 (OD值为8.0±2.0)。种子罐培养结束后，无菌操作转移到 离心管中，离心l5mmn，加新鲜菌种培养基，将菌体制成 菌悬液，并加入甘油使其浓度达到18%，分装于Ependorf 管中，每支(1.0±0.2)mL。 ▪ (3)保存。分装完毕，于-2O℃放置16～20h，在-70℃下可 保存3年
任务2干扰素发酵工艺过程控制 LOGO
LOGO 任务2 干扰素发酵工艺过程控制
一、 干扰素发酵工艺过程 生产菌 菌种活化←蒸汽灭菌 种子罐培养←燕汽灭菌 配制培养基←一原料 发群培养←惑汽天商 发酵液降温 ↓ 菌体收集 菌体冷冻保存 ·图3-1干扰素-a2b发酵工艺流程图 LOGO
LOGO 一、干扰素发酵工艺过程 ▪ 图3-1干扰素- a 2b发酵工艺流程图
(①)菌种制备取-70℃下保存的甘油管菌种（工作种子批），于室温下融化。 然后，接人摇瓶，培养温度30℃，pH值7.0,250r/min活化培养(18士2) h后。进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。 (2)种子罐培养将己活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量 为10%，培养温度30℃，pH值7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶 解氧为30%，培养3~4h,当0D值达到4.0以上时，转人到发酵罐中，进行二 级放大培养，同时取样进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂茵。 (3)发酵罐培养。将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养 温度30℃，p值7.0。级联调节通气量和搅拌转速。控制溶解氧为30%，培 养4h。然后控制培养温度20℃，pH值6.0，溶解氧为60%，继续培养5 6.5h。同时进行发酵液杂菌检查。当0D值达9.0士1.0后，用5℃冷却水快速 降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转人收集罐中，加人冰块 使温度迅速降至10℃以下。 (4)菌体收集。将己降温至20℃以下的发酵液转人连续流离心机，16000r/ min离心收集。，进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体于燥失重、质粒结构 一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体于-20℃冰柜中保存时。不得超过 12个月。每保存3个月，检查一次活性。 LOGO
LOGO (1)菌种制备 取-7O℃下保存的甘油管菌种 (工作种子批)，于室温下融化。 然后，接人摇瓶，培养温度30℃，pH值7.0，250r/min活化培养 (18士2) h后。进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。 (2)种子罐培养 将己活化的菌种接入装有 30L培养基的种子罐中，接种量 为 10%，培养温度 30℃，pH值7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶 解氧为30%，培养3～4h，当OD值达到4.0以上时，转人到发酵罐中，进行二 级放大培养，同时取样进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂茵。 （3)发酵罐培养。将种子液通入 300L培养基的发酵罐中，接种量 10%，培养 温度30℃，pH值7.0。级联调节通气量和搅拌转速。控制溶解氧为 30%，培 养4h。然后控制培养温度20℃，pH值6.0，溶解氧为 60%，继续培养 5～ 6.5h。同时进行发酵液杂菌检查。当OD值达9.0士1.0后，用 5℃冷却水快速 降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转人收集罐中，加人冰块 使温度迅速降至10℃以下。 (4)菌体收集。将己降温至2O℃ 以下的发酵液转人连续流离心机，1600Or/ min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构 一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体于-20℃冰柜中保存时。不得超过 12个月。每保存 3个月，检查一次活性
任务3干扰素的分离纯化工艺过程 LOGO
LOGO 任务3干扰素的分离纯化工艺过程
原料 冲 沉 多 令 淀 心 干扰素 制 存 阴 离 沉 超 武 曾 心→ 子 淀 淀 析 析 层 滤 析 阴 超 凝 加 透 子 菌 滤 层 分 层 塞 盖库 析 装 图3-2干扰素-a2b提取纯化工艺流程图 LOGO
LOGO 图3-2干扰素- a 2b提取纯化工艺流程图