第九章基因工程和基因组学
第九章 基因工程和基因组学
第一节基因工程 (一)基因工程的概念 1.遗传工程 广义:细胞工程--如体细胞、原生质体的培养与杂交 细胞器工程--细胞核的移植:回交,克隆羊 染色体工程--整条染色体或染色体片断的切割或转移 基因工程 狭义:基因工程:体外不经过有性繁殖,有目的地使DNA发生重 组的技术体系。故又称重组DNA技术。 2.克隆( clone) n.无性繁殖系:无性繁殖系,遗传物质来源和组成完全相同。 V.获得无性繁殖系的过程一即获得某种特异DNA片段,并大量 扩增的过程
第一节 基因工程 （一）基因工程的概念 1. 遗传工程 广义： 细胞工程 ------如体细胞、原生质体的培养与杂交 细胞器工程------细胞核的移植： 回交，克隆羊 染色体工程------整条染色体或染色体片断的切割或转移。 基因工程 狭义：基因工程 ：体外不经过有性繁殖，有目的地使DNA发生重 组的技术体系。故又称重组DNA技术。 2. 克隆（clone） n. 无性繁殖系：无性繁殖系，遗传物质来源和组成完全相同。 v. 获得无性繁殖系的过程－即获得某种特异DNA片段，并大量 扩增的过程
基因工程的内容与步骤 基因组DNA CDNA mRNA 机械或者限制性内切酶切割 DNA片段(包括某目的基因的片段) 将DNA片段连接到载体 →重组DNA分子 导入到合适的受体细胞,重组DNA分 子在受体细胞中增殖
二、基因工程的内容与步骤 机械或者限制性内切酶切割 基因组DNA cDNA mRNA DNA片段（包括某目的基因的片段） 将DNA片段连接到载体 → 重组DNA分子 导入到合适的受体细胞，重组DNA分 子在受体细胞中增殖
筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞 鉴定出带有目的基因片段的克 隆,回收、纯化、分析该片段 转基因
筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞 鉴定出带有目的基因片段的克 隆，回收、纯化、分析该片段。 转基因
DNA CoS L OS R (CDNA) Bam hi Sau 3a OS Cos R 连接 基因克隆 重组DNA分子 基因文库的构建 体外装配 重组噬菌体感染 E Coli 基因文库 000cDNA文库 筛选 连接 转基因 质粒 酶切
Cos L Cos R Bam H I Sau 3A gDNA (cDNA) + 质粒 酶切 连接 转基因 λ 连接 体外装配 重组噬菌体感染E.Coli Cos L Cos R 重组DNA分子 基因文库 cDNA文库 基因克隆 基因文库的构建 筛选
限制性内切酶 定义:限制性、内切酶 >类型: I型:特异识别位点,但切割位点随机。需要ATP Mg2等。基因工程中无用:EcoB;EcoK I型:特异识别位点和切割位点。只需Mg2。 识别位点:回文对称序列( palindrome) 粘性末端: EcoRI Hind ll:5突出 Noti pst i 3突出 平头末端:SmaI
三、限制性内切酶 ➢ 定义：限制性、内切酶 ➢ 类型： I 型： 特异识别位点，但切割位点随机。需要ATP、 Mg2+等。基因工程中无用：EcoB; EcoK II 型: 特异识别位点和切割位点。只需Mg2+ 。 识别位点：回文对称序列（palindrome） 粘性末端：EcoR I Hind III：5’突出 Not I Pst I 3’突出 平头末端：Sma I
ECORI. GAATTC GAATTC 3 CTTAAG CTTAAG 5, AATTC 3 CTTAA Hind III: v 5,AAGCTT AAGCTT 3 3 TTCGAA TTCGAA 5 AGCTT 3 3 TTCGA
EcoR I: Hind III: 5’ 3’ GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG AATTC G G CTTAA AAGCTT AAGCTT TTCGAA TTCGAA AGCTT A A TTCGA 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
Pst i CTGCAG CTGCAG 3 GACGTC GACGTC G CTGCA 3 ACGTC G SmaI 5 CCCGGG CCCGGG GGGCCC GGGCCC GGG CCC 3 CCC GGG
Pst I Sma I CTGCAG CTGCAG GACGTC GACGTC G CTGCA ACGTC G 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ CCCGGG CCCGGG GGGCCC GGGCCC GGG CCC CCC GGG
四、载体( vector) 类型:质粒(含粘粒)、病毒(噬菌体) YAC、BAC、PAC等 >条件: 1.具有复制原点(ori),在宿主细胞中能自我复制并带动 外源DNA复制,稳定保持 2.具有多克隆位点(MCS- multiple cloning sites),即 有多种限制酶切位点,各种位点是唯一的,且与载体的 复制原点和标记基因位点无关 3有可以作为重组DNA分子筛选的标记基因。至少一个, 寄主没有这种基因 4.容易从寄主中分离回收
四、 载体（vector） ➢类型：质粒（含粘粒）、病毒（噬菌体）、 YAC、BAC、PAC 等 ➢条件： 1. 具有复制原点（ori），在宿主细胞中能自我复制并带动 外源DNA复制，稳定保持。 2. 具有多克隆位点（MCS－multiple cloning sites ），即 有多种限制酶切位点，各种位点是唯一的，且与载体的 复制原点和标记基因位点无关。 3. 有可以作为重组DNA分子筛选的标记基因。至少一个， 寄主没有这种基因。 4. 容易从寄主中分离回收
EcoR I Sac I Kpn I Sma I BamH >常见的载体 acZ (一)克隆载体 1.质粒( plasmid) pUC18 2686 bps pBR312-缺点:拷贝数低 承载量小:3-4Kb pUC19-a.本身较小:2.6-27kb, 可插入5-12Kb 图9-3细菌质粒pUC18 pUC18具有细菌染色体的acI基因及 b.高拷贝数:500 部分lacZ基因,可用α-互补法选择阳 c.可以LacZ基因蓝白斑筛选(蓝斑不一定没有插 入,但白斑一定有插入) IPTG Lac Z表达→Xgal分解→蓝色
➢ 常见的载体 （一）克隆载体 1. 质粒（plasmid） pBR312－缺点：拷贝数低 承载量小：3-4 Kb pUC19 －a. 本身较小：2.6－2.7kb， 可插入5-12Kb b. 高拷贝数：500 c. 可以 LacZ 基因蓝白斑筛选（蓝斑不一定没有插 入，但白斑一定有插入） IPTG→Lac Z表达→X-gal分解→蓝色