口腔粘膜脱落细胞采集 【使用方式】 一灰口异 签放置在来样试管中 洗净双手 手出确忽 要头内 注意:为了保证样本不被食物或者饮料污染,取样前30mn内请勿进食和饮 水 1、洗净双手 2、取出棉签; 3、手持棉签,伸进口腔,从口腔内侧颊粘膜处(腮帮子内侧)反复擦拭40 次以上(不时旋转棉棒),取出棉签; 4、从试管盒中取岀试管,打开管盖,将棉签头部伸入管中,用力掰断,将 棉签头部留在管内,并扣紧管盖。 二、口腔拭子基因组DNA提取(天根Kit,DP322) 使用前,请先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇,加入体积请参照 瓶上的标签。 1.处理材料 将在面颊內擦拭过的棉签转置于2m离心管中,用剪刀将棉签部分从其杆 上剪下,加入如0ou缓冲液GA
一、口腔粘膜脱落细胞采集 注意：为了保证样本不被食物或者饮料污染，取样前 30min 内请勿进食和饮 水。 1、洗净双手； 2、取出棉签； 3、手持棉签，伸进口腔，从口腔内侧颊粘膜处（腮帮子内侧）反复擦拭 40 次以上（不时旋转棉棒），取出棉签； 4、从试管盒中取出试管，打开管盖，将棉签头部伸入管中，用力掰断，将 棉签头部留在管内，并扣紧管盖。 二、口腔拭子基因组 DNA 提取（天根 Kit，DP322） 使用前，请先在缓冲液 GD 和漂洗液 PW 中加入无水乙醇，加入体积请参照 瓶上的标签。 1. 处理材料： 将在面颊内擦拭过的棉签转置于 2ml 离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆 上剪下，加入 600ul 缓冲液 GA
注意如果需要去除RNA,可加入4山 RNase a(100mg/m溶液客户自备, 目录号:RT405-12),振荡15sec,室温放置5min 加入40 Jul Proteinase K溶液,涡旋10sec混匀,56°C放置20min,其间每7 min涡旋混匀数次。 3.加入600u缓冲液GB,充分颠倒混匀,70°C放置10min。此时溶液应变清 亮,简短离心以去除管盖内壁的液滴,然后挤压去除拭子,将尽可能多的裂解液 转移至新的离心管中。 注意1:加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀,一般70°C放置时会消失,不 会影响后续实验。如溶液未变清亮,说明细胞裂解不彻底,可能导致提取DNA 量少和提取出的DNA不纯。 注意2:如果由于拭子上细胞数少导致提取的基因组DNA少于1g,可以在 添加缓冲液GB的同时添加 Carrier rna(客户自备,目录号:RT416) 4.加300u无水乙醇,充分颠倒混匀,简短离心以去除管盖内壁的液滴。 注意加入无水乙醇后可能会出现絮状沉淀,但不影响DNA提取。 5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR2中吸附柱CR2放入 收集管中).12,000rpm(-13,400x×g)离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附 柱CR2放回收集管中。 注意:第4步液体总体积超过80u,分两次转移
注意:如果需要去除RNA，可加入4 μl RNase A(100 mg/ml)溶液(客户自备， 目录号:RT405-12)，振荡15 sec，室温放置5 min。 2. 加入40ul Proteinase K溶液，涡旋10 sec混匀，56°C放置20 min，其间每7 min涡旋混匀数次。 3. 加入600ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10 min。此时溶液应变清 亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，然后挤压去除拭子，将尽可能多的裂解液 转移至新的离心管中。 注意1: 加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70°C放置时会消失，不 会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA 量少和提取出的DNA不纯。 注意2: 如果由于拭子上细胞数少导致提取的基因组DNA少于1 μg，可以在 添加缓冲液GB的同时添加Carrier RNA(客户自备，目录号:RT416)。 4. 加300ul无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。 注意:加入无水乙醇后可能会出现絮状沉淀，但不影响DNA提取。 5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR2中(吸附柱CR2放入 收集管中)， 12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附 柱CR2放回收集管中。 注意：第4步液体总体积超过800ul，分两次转移
6向吸附柱CR2中加入500μ缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙 醇),12,000rpm(-13400×g)离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CR2 放回收集管中。 7.向吸附柱CR2中加入600山漂洗液PW使用前请先检查是否已加入无水 乙醇),12,000rpm(-13400×g)离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CR 放回收集管 8.重复操作步骤7。 9.12000rpm(-13400×g)离心2min,倒掉废液。将吸附柱CR2室温放置数 分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,漂洗液中乙醇的残留 会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。 10.将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加 20-50山洗脱缓冲液TB,室温放置2-5min,12000pm(-13400×g)离心2mn。 注意:洗脱缓冲液体积不应少于20以,体积过小影响回收效率。为增加基因 组DNA的得率,可将离心得到的溶液再加入吸附柱CR2中,室温放置2min, 12,000rpm(-13,400×g)离心2min。洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。若 用dH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0-85范围内,pH值低于7.0会降低洗脱效 率;且DNA产物应保存在-20°C,以防DNA降解
6.向吸附柱CR2中加入500 μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙 醇)，12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2 放回收集管中。 7. 向吸附柱CR2中加入600 μl 漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水 乙醇)，12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2 放回收集管。 8. 重复操作步骤7。 9. 12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR2室温放置数 分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注意: 这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留 会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。 10. 将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 20-50 μl 洗脱缓冲液TB，室温放置2-5 min，12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min。 注意:洗脱缓冲液体积不应少于20 μl，体积过小影响回收效率。为增加基因 组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CR2中，室温放置2 min， 12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min。洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。若 用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效 率;且DNA产物应保存 在-20°C，以防DNA降解
DNA浓度及纯度检测 得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素 有关。回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯 度 DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为1相当于大约50μg/m双链 DNA、40μg/m单链DNA。 oD260/○D280比值应为1.7-19,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用 ddH2O,比值会偏低,因为pH值和离子存在会影响光吸收值,但并不表示纯度 琼脂糖凝胶电泳 1、配置琼脂糖凝胶(1%)(以配置100m琼脂糖凝胶为例) 1)称取1g琼脂糖,倒入锥形瓶中; 2)加10om1κAE,摇晃均匀,放入微波炉中加热至琼脂糖完全溶解 (其间可取出锥形瓶摇几次,以促进琼脂糖溶解); 3)取出锥形瓶,待瓶身温度降至50度左右时(不烫手),加入1-2u 荧光染料,摇匀 4)倒入制胶板中,插上梳子,待其凝固。 2、电泳 1)从胶板上取下凝胶,在1*TAE中浸泡使胶孔中充满1*TAE(可直接在
DNA浓度及纯度检测 得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素 有关。回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯 度。 DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50 μg/ml双链 DNA、40 μg/ml单链DNA。 OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用 ddH2O，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度 低。 琼脂糖凝胶电泳 1、配置琼脂糖凝胶（1%）（以配置 100ml 琼脂糖凝胶为例） 1) 称取 1g 琼脂糖，倒入锥形瓶中； 2）加 100ml 1*TAE，摇晃均匀，放入微波炉中加热至琼脂糖完全溶解 （其间可取出锥形瓶摇几次，以促进琼脂糖溶解）； 3）取出锥形瓶，待瓶身温度降至 50 度左右时（不烫手），加入 1-2ul 荧光染料，摇匀； 4）倒入制胶板中，插上梳子，待其凝固。 2、电泳 1）从胶板上取下凝胶，在 1*TAE 中浸泡使胶孔中充满 1*TAE（可直接在
电泳槽中加样,也可把凝胶取出加样); 2)将PCR产物与6 Loading Buffer充分混匀 3)将混合液加至凝胶孔中(注意留出加 marker的孔) 4)加 marker(根据片段大小选择合适大小的 marker) 5)选择合适的电压开始电泳(一般选择160V,10-15mi 6)停止电泳,在凝胶成像仪上观察并拍照
电泳槽中加样，也可把凝胶取出加样）； 2）将 PCR 产物与 6*Loading Buffer 充分混匀； 3）将混合液加至凝胶孔中（注意留出加 marker 的孔）； 4）加 marker（根据片段大小选择合适大小的 marker）； 5）选择合适的电压开始电泳（一般选择 160V，10-15min）； 6）停止电泳，在凝胶成像仪上观察并拍照