第34卷 分析化学( FENXIHUAXUE)评述与进展 第6期 2006年6月 Chinese Joumal of Analytical Chem istry 884~888 金纳米颗粒聚集以及金纳米探针微阵列技术研究进展 逄键涛文思远王升启 军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京100850) 摘要金纳米颗粒(GNP)探针正引起科学家们越来越多的兴趣。本文主要综述了基于(NP自组装聚集反 应的生物检测和微阵列金标银染检测的最新进展,对(NP在电化学等其他领域的研究前沿也进行了探讨 引用文献41篇。 关键词金纳米颗粒,微阵列,生物检测,评述 1引言 金纳米颗粒(CNP)是直径为08~250m的缔合胶体,具有纳米表面效应、量子效应、宏观量子 隧道效应。按粒子尺寸和聚集情况,(NP可显示不同的颜色,已被广泛用于光学、电学、电子显微镜检 测的生物分子标记1。单个纳米颗粒的尺寸和颗粒间的组装形式,使胶体Au溶液表现出不同的整体 特征。生物分子可参与到(NP的聚集和组装过程中,从而干扰(NP的原始组装方式。通过胶体Au溶 液最终的物理状态(如颜色吸光度等)可得到参与组装的生物分子的质、量“特征,达到检测的目的。 另外,(NP逐渐在生物芯片检测中显现出应用前景。生物芯片技术本身是纳米尺度的分子操作和组装 技术,芯片诊断纳米检测等技术可以在此得到良好的融合。本文着重就GNP自组装以及QNP探针微 阵列技术进展作一综述 2生物分子辅助的GNP聚集和组装 21DNA-GNP探针 灵敏度高、特异性强、快速简单、低成本是生物检测的重要指标。基于(NP聚集反应的分子诊断方 法能满足这些要求。 Mirk in发现DNA特异杂交可使DNAλu颗粒自组装为复合结构,开创了(NP用 于生物检测的新领域。GNP经巯基修饰的短链DNA修饰成为编码探针,溶液中加入目标互补 DNA后纳米颗粒发生有序可逆的聚集反应1。聚集后溶液颜色发生红一桃红一紫色变化,几小时出 现桃灰色沉淀(DNA狡体金沉淀)。该现象是DNA介导的胶体狡体键合,其过程是可逆的。系统在没 有优化的情况下能检测10血ol的寡核苷酸。 DNA修饰的GNP以非交联结构聚集,对于颗粒表面结合的杂交体末端错配有很好的选择性,可 对单核苷酸多态性(sNP)进行检测。5个人瘤细胞系的基因组DNA的检测结果与传统方法(质谱、直 接测序)一致。这种方法不需要复杂的设备,为sNP医护现场诊断、个性化医疗提供了可能。 Storhofi 等研究了QNP距离和光学性质的关系,开发出“杂交读出的比色检测方法,鉴别核酸序列。DNA 修饰的金纳米探针识别核酸目标分子后发生颜色变化,可检测到mol(10mol)级的核酸,不需要目 标分子的扩增或信号放大。 Sonn ichsen等采用等离子体耦合对金银纳米颗粒间距进行测量,研究了 金银纳米颗粒二聚体的实时组装以及单个DNA分子杂交的动力学。“等离子体标尺呵连续监控分子 间距离上限达到70mm,时间超过50min 22非标记DNA检测 双链DNA(dΦNA)比单链DNA(sNA)表面负电荷堆积程度高,并且d∮NA的双螺旋结构使氮 (N)、硫(S)等对(NP亲和性高的原子包埋更深,所以SNA和dNA对(NP有不同吸附力 Lj等据此设计了基于Au颗粒聚集反应的核酸杂交比色检测方法。sNA可吸附负电荷纳米金颗 2005408-10收稿;2005-1203接受 本文系国家863资助项目(Na2004BA519A g1994-2009ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
金纳米颗粒聚集以及金纳米探针 2微阵列技术研究进展 逄键涛 文思远 王升启 3 (军事医学科学院放射与辐射医学研究所 ,北京 100850) 摘 要 金纳米颗粒 (GNP)探针正引起科学家们越来越多的兴趣。本文主要综述了基于 GNP自组装聚集反 应的生物检测和微阵列 2金标银染检测的最新进展 ,对 GNP在电化学等其他领域的研究前沿也进行了探讨。 引用文献 41篇。 关键词 金纳米颗粒 ,微阵列 ,生物检测 ,评述 2005208210收稿 ; 2005212203接受 本文系国家 863资助项目 (No. 2004BA519A46) 1 引 言 金纳米颗粒 ( GNP)是直径为 0. 8～250 nm [ 1 ]的缔合胶体 ,具有纳米表面效应、量子效应、宏观量子 隧道效应。按粒子尺寸和聚集情况 , GNP可显示不同的颜色 ,已被广泛用于光学、电学、电子显微镜检 测的生物分子标记 [ 2 ]。单个纳米颗粒的尺寸和颗粒间的组装形式 ,使胶体 Au溶液表现出不同的整体 特征。生物分子可参与到 GNP的聚集和组装过程中 ,从而干扰 GNP的原始组装方式。通过胶体 Au溶 液最终的物理状态 (如颜色、吸光度等 )可得到参与组装的生物分子的“质、量 ”特征 ,达到检测的目的。 另外 , GNP逐渐在生物芯片检测中显现出应用前景。生物芯片技术本身是纳米尺度的分子操作和组装 技术 ,芯片诊断、纳米检测等技术可以在此得到良好的融合。本文着重就 GNP自组装以及 GNP探针 2微 阵列技术进展作一综述。 2 生物分子辅助的 GNP聚集和组装 2. 1 D NA2GNP探针 灵敏度高、特异性强、快速简单、低成本是生物检测的重要指标。基于 GNP聚集反应的分子诊断方 法能满足这些要求。M irkin发现 DNA特异杂交可使 DNA2Au颗粒自组装为复合结构 ,开创了 GNP用 于生物检测的新领域 [ 3 ]。GNP经巯基修饰的短链 DNA 修饰成为编码探针 [ 4 ] ,溶液中加入目标互补 DNA后 ,纳米颗粒发生有序、可逆的聚集反应 [ 5 ]。聚集后溶液颜色发生红 →桃红 →紫色变化 ,几小时出 现桃灰色沉淀 (DNA2胶体金沉淀 )。该现象是 DNA介导的胶体 2胶体键合 ,其过程是可逆的。系统在没 有优化的情况下能检测 10 fmol的寡核苷酸。 DNA修饰的 GNP以非交联结构聚集 ,对于颗粒表面结合的杂交体末端错配有很好的选择性 [ 6 ] ,可 对单核苷酸多态性 (SNP)进行检测。5个人瘤细胞系的基因组 DNA的检测结果与传统方法 (质谱、直 接测序 )一致。这种方法不需要复杂的设备 ,为 SNP医护现场诊断、个性化医疗提供了可能。Storhoff 等 [ 7 ]研究了 GNP距离和光学性质的关系 ,开发出“杂交 2读出 ”的比色检测方法 ,鉴别核酸序列。DNA 修饰的金纳米探针识别核酸目标分子后发生颜色变化 ,可检测到 zmol(10 - 21 mol)级的核酸 ,不需要目 标分子的扩增或信号放大。SÊnnichsen等 [ 8 ]采用等离子体耦合对金银纳米颗粒间距进行测量 ,研究了 金银纳米颗粒二聚体的实时组装以及单个 DNA分子杂交的动力学。“等离子体标尺 ”可连续监控分子 间距离上限达到 70 nm,时间超过 50 m in。 2. 2 非标记 D NA检测 双链 DNA ( dsDNA)比单链 DNA ( ssDNA)表面负电荷堆积程度高 ,并且 dsDNA的双螺旋结构使氮 (N)、硫 ( S)等对 GNP亲和性高的原子包埋更深 ,所以 ssDNA 和 dsDNA 对 GNP有不同吸附力。 Li等 [ 9, 10 ]据此设计了基于 Au颗粒聚集反应的核酸杂交比色检测方法。 ssDNA可吸附负电荷纳米金颗 第 34卷 2006年 6月 分析化学 ( FENX I HUAXUE) 评述与进展 Chinese Journal of Analytical Chem istry 第 6期 884～888
逄键涛等:金纳米颗粒聚集以及金纳米探针微阵列技术研究进展 粒,其结合速率与序列长度和温度有关。(NP吸附sNA之后处于稳定状态,不会发生盐离子引起的 聚集反应。纳米颗粒对核酸的吸附为静电作用,不需要对λu颗粒、探针或靶序列进行共价修饰。目标 分子和探针的结合是在溶液中进行的,其杂交时间少于lmn,整个检测只需5min,不需借助仪器可检 测到小于100fol(105mo靶分子 23蛋白质检测 标准凝胶免疫测定(SP队)是基于(NP的生物特异性聚合和分光光度技术,用于蛋白质的检测 Dykman1报道了一种新型的SP技术方法:采用微量滴定免疫板和酶联免疫吸附测定(ENA)阅读 器。以15mAu颗粒偶联的蛋白A,检测G,研究比较了新型SPH和普通SP。该方法的原理是生 物分子纳米金溶液的消光光谱在目标分子加入前后的变化,可能与Au颗粒的聚合作用有关。 3GNP标记与微阵列检测 随着高并行化微型化检测需求的增长,荧光DNA芯片在DNA诊断学方面受到的关注越来越多。 荧光检测已被证明为有效可用并得到很好的开发,但它有一些问题难以解决,比如染料的低稳定性、物 理化学环境影响到其发光强度、昂贵的检测设备等。基于GNP标记和银増强技术的微阵列检测技术 方法简单,成本低,信号灵敏、稳定,不受外部环境的影响,有利于微阵列技术在中小型医院的推广和医 护现场检测2 31GNP标记微阵列检测原理 NP与生物活性分子的交联可得到大量新型的标记探针,如:Au脂质、AuNT以及 AUATP 等1。GNP在固体表面的组装定位和金标银增强技术是纳米颗粒微阵列检测的理论基础。 Cski等H用扫描原子力显微镜研究了纳米金颗粒标记DNA分子在芯片表面的分布和标记情 况。 Peschel研究了(NP的自组装过程及结构性质,尺寸及结构依赖物理性质。DNA具有独特的识 别能力和物理化学稳定性,可作为GNP的连接分子。DNA修饰的Au胶体颗粒(1~40m)特异性固定 在互补DNA修饰的固体表面构建出表面m结构。 Au-Ag染色法是一种灵敏特异的可视化检测技术,源自现代照相技术、组织化学和免疫金技术,经 过近10年来的优化组合,现已得到广泛应用。Ag在Au标记位点特异性沉淀,是一种光学或电子显 微镜下的低放大率可视化方法。 Festa等对(NP微阵列检测技术条件进行了优化,研究了不同的 基底清洁、活化以及封闭方法,并优化了纳米颗粒标记及其他程序 32XNA(DNA、RNA)及SNP检测 Tatn等最先开发出(NP用于DNA阵列分析的简单方法,包括寡核苷酸修饰GNP探针和平板 扫描仪。αNP标记的寡核苷酸目标分子在固体表面的熔解温度发生改变。寡核苷酸互补序列与单核 苷酸错配序列熔解温度的差异,可用于二者的鉴别,选择性是荧光标记方法的3倍。Ag增强信号放大 方法可提高扫描色度阵列检测系统的灵敏度,超出荧光系统2个数量级。 A lexand等提出了一种 新型的比色检测方法,使微阵列技术可能成为用于科研和临床中的高效、低成本检测工具。(NP通过 亲和素结合在生物素化的DNA上,其结果信号产生于Ag在(NP表面的还原沉淀。该比色方法与荧 光检测方法相比较,检出限相当,大约为1anol(101mo生物素化的目标DNA。wei等采用寡核 苷酸和拉曼活性染料标记的αNP探针实现了寡核苷酸的多重检测。Ag沉淀形成的Auλg核壳结构可 引发染料标记颗粒的表面增强拉曼散射。方法在未优化条件下的检出限为20ol具有高灵敏度和高 特异性的特点。采用拉曼标签作为窄带光谱指纹,据此可随意设计所需探针增加了方法的多重和多比 率检测能力。Ba等1提出了一个微阵列检测方法,可进行多重sNP分型,不需目标扩增和去复杂性 该方法依赖于(NP探针的高灵敏度,不需要酶的参与。特异性源于寡核苷酸和纳米探针的两步夹心杂 交。用非扩增人基因组DNA样品检测3个血栓症基因的可能基因型,表明这种多重SNP检测方法重现 性良好。该阵列检测方法简单、快速、稳健,适于多重SNP的医护现场检测 33微生物诊断 微阵列已逐步成为细菌检测和鉴定的新方法,具有高并行性检测的特征,但检测方法的复杂性和灵 o1994-2009ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
粒 ,其结合速率与序列长度和温度有关。GNP吸附 ssDNA之后处于稳定状态 ,不会发生盐离子引起的 聚集反应。纳米颗粒对核酸的吸附为静电作用 ,不需要对 Au颗粒、探针或靶序列进行共价修饰。目标 分子和探针的结合是在溶液中进行的 ,其杂交时间少于 1m in,整个检测只需 5 m in,不需借助仪器可检 测到小于 100 fmol(10 - 15 mol)靶分子。 2. 3 蛋白质检测 标准凝胶免疫测定 (SPIA )是基于 GNP的生物特异性聚合和分光光度技术 ,用于蛋白质的检测。 Dykman [ 11 ]报道了一种新型的 SPIA技术方法 :采用微量滴定免疫板和酶联免疫吸附测定 ( EL ISA )阅读 器。以 15 nm Au颗粒偶联的蛋白 A,检测 IgG,研究比较了新型 SPIA和普通 SPIA。该方法的原理是生 物分子 2纳米金溶液的消光光谱在目标分子加入前后的变化 ,可能与 Au颗粒的聚合作用有关。 3 GNP标记与微阵列检测 随着高并行化、微型化检测需求的增长 ,荧光 DNA芯片在 DNA诊断学方面受到的关注越来越多。 荧光检测已被证明为有效可用并得到很好的开发 ,但它有一些问题难以解决 ,比如染料的低稳定性、物 理化学环境影响到其发光强度、昂贵的检测设备等。基于 GNP标记和银增强技术的微阵列检测技术 , 方法简单 ,成本低 ,信号灵敏、稳定 ,不受外部环境的影响 ,有利于微阵列技术在中小型医院的推广和医 护现场检测 [ 12 ]。 3. 1 GNP标记微阵列检测原理 GNP与生物活性分子的交联可得到大量新型的标记探针 ,如 : Au2脂质、Au2N i2NTA 以及 Au2ATP 等 [ 13 ]。GNP在固体表面的组装定位和金标银增强技术是纳米颗粒 2微阵列检测的理论基础。 Csáki等 [ 14 ]采用扫描原子力显微镜研究了纳米金颗粒标记 DNA分子在芯片表面的分布和标记情 况。Peschel [ 15 ]研究了 GNP的自组装过程及结构性质 ,尺寸及结构依赖物理性质。DNA具有独特的识 别能力和物理化学稳定性 ,可作为 GNP的连接分子。DNA修饰的 Au胶体颗粒 (1～40 nm)特异性固定 在互补 DNA修饰的固体表面 ,构建出表面 nm结构。 Au2Ag染色法是一种灵敏特异的可视化检测技术 ,源自现代照相技术、组织化学和免疫金技术 ,经 过近 10年来的优化组合 ,现已得到广泛应用 [ 16 ]。Ag在 Au标记位点特异性沉淀 ,是一种光学或电子显 微镜下的低放大率可视化方法。Festag等 [ 17 ]对 GNP2微阵列检测技术条件进行了优化 ,研究了不同的 基底清洁、活化以及封闭方法 ,并优化了纳米颗粒标记及其他程序。 3. 2 XNA( D NA、RNA)及 SNP检测 Taton等 [ 18 ]最先开发出 GNP用于 DNA阵列分析的简单方法 ,包括寡核苷酸修饰 GNP探针和平板 扫描仪。GNP标记的寡核苷酸目标分子在固体表面的熔解温度发生改变。寡核苷酸互补序列与单核 苷酸错配序列熔解温度的差异 ,可用于二者的鉴别 ,选择性是荧光标记方法的 3倍。Ag增强信号放大 方法可提高扫描色度阵列检测系统的灵敏度 ,超出荧光系统 2个数量级。A lexandre等 [ 19 ]提出了一种 新型的比色检测方法 ,使微阵列技术可能成为用于科研和临床中的高效、低成本检测工具。GNP通过 亲和素结合在生物素化的 DNA上 ,其结果信号产生于 Ag +在 GNP表面的还原沉淀。该比色方法与荧 光检测方法相比较 ,检出限相当 ,大约为 1 amol(10 - 18 mol)生物素化的目标 DNA。Wei等 [ 20 ]采用寡核 苷酸和拉曼活性染料标记的 GNP探针实现了寡核苷酸的多重检测。Ag沉淀形成的 Au2Ag核壳结构可 引发染料标记颗粒的表面增强拉曼散射。方法在未优化条件下的检出限为 20 fmol,具有高灵敏度和高 特异性的特点。采用拉曼标签作为窄带光谱指纹 ,据此可随意设计所需探针 ,增加了方法的多重和多比 率检测能力。Bao等 [ 21 ]提出了一个微阵列检测方法 ,可进行多重 SNP分型 ,不需目标扩增和去复杂性。 该方法依赖于 GNP探针的高灵敏度 ,不需要酶的参与。特异性源于寡核苷酸和纳米探针的两步夹心杂 交。用非扩增人基因组 DNA样品检测 3个血栓症基因的可能基因型 ,表明这种多重 SNP检测方法重现 性良好。该阵列检测方法简单、快速、稳健 ,适于多重 SNP的医护现场检测。 3. 3 微生物诊断 微阵列已逐步成为细菌检测和鉴定的新方法 ,具有高并行性检测的特征 ,但检测方法的复杂性和灵 第 6期 逄键涛等 :金纳米颗粒聚集以及金纳米探针 2微阵列技术研究进展 885
分析化学 第34卷 敏度问题成为技术瓶颈。 Francoisi等2报道了一种新的检测技术,直接标记细菌总RNA,避免了酶放 大的多步反应和可能的偏向性(如PR)。该研究比较了白光光源性能和2种激光荧光扫描仪检测的 可靠性和灵敏度。结果显示:纳米颗粒标记的细菌RNA能产生可重复性的共振光散射信号,强度至少 是当前最新的共聚焦荧光信号的50倍 Wang等2开发了一种基于纳米颗粒放大和夹心检测技术的乙肝病毒基因检测芯片,HBV特异性 探针固定于玻片表面,与不同血清样本的PCR(合酶链式反应)产物杂交,杂交信号能容易地可视化 观察。庞代文等采用纳米颗粒基因探针的可视化基因检测技术,采用“纳米放大和银染色方法,对 目标分子夹心杂交进行检测。 Ramakrishnan等131采用金纳米探针结合微阵列技术检测甲氧西林耐药 性金黄色葡萄球菌。以上方法避免了放射性荧光或目标分子的扩增(PCR),具有简单、快速、灵敏度 高、低成本的特点。 34表达谱研究 基于微阵列方法的基因表达分析在现代生物学中起了关键作用,但目前的微阵列基因表达谱大都 需要反转录将mRNA转变为标记ΦNA或cRNA。在cRNA反转录过程中包括目标放大步骤,克服了普 通荧光方法低灵敏度的缺点。 Huber等报道了一种基于微阵列无酶扩增的基因表达分析系统,采用 非扩增的人总RNA样品作为目标核酸。杂交固定在微阵列表面的RNA分子通过其polA尾与olgo dL修饰的αNP探针杂交,信号由自动金相放大,然后由纳米颗粒介导的光散射检测。纳米颗粒探针灵 敏度高,可用少至05ug非扩增总RNA杂交进行基因差异表达分析,而不需费时、费力的样品标记 <em武NA的表达谱研究对于mRNA的生物功能研究有重要意义。为避免使用高成本的检测仪器 g等在实验中采用了纳米金颗粒探针及Ag增强方法,开发了一种新型的m武NA表达谱微阵列。 作者制作了检测11种来自水稻根、叶的m武NA的微阵列模型,有很好的实验重现性并与 Northem bot 结果一致。Stof等13用巯基修饰寡核苷酸的(NP探针,检测互补的目标DNA。玻片表面固定有寡 核苷酸捕获探针,用于捕获日标DNA,之后目标DNA通过(NP探针检测。Ag放大后的信号通过简单 的光学系统检测散失波诱导光散射。与Cy3荧光标记相比,该方法的信号增强了100倍。可直接检测 微生物的非扩增基因组DNA,并可检测鉴别人基因组SNP 最近,DNA微阵列方法被开发用于检测多个基因的甲基化状况。J等1开发了一种 linkerPCR检 测4种基因的甲基化状况的微阵列。QNP是通过亲和素结合在生物素化的DNA上的,Ag在纳米金颗 粒表面还原沉淀,可检测01fnol的目标DNA。实验结果与甲基化特异的 PCR(MSP)和双硫DNA测序 结果一致。因此它可作为一种价格低廉、有用的灵敏检测工具,用于多基因甲基化检测 35蛋白质检测 蛋白微阵列杂交可以用许多种方法来检测,实用性差,难于推广,原因是这些方法都需要大型、昂贵 的仪器设备。Han等开发出一种基于GNP标记抗体的简单、便宜的检测方法,信号可通过商品化的 办公用桌面平板扫描仪可视化获得。扫描电子显微镜硏究显示:平板扫描仪得到的信号与抗体金结合 的表面密度有关,平板扫描仪可检测6amol的抗体金颗粒偶联物。该检测系统用于竞争免疫检测水样 中农药残留代谢物BAM浓度,结果证明金标抗体检测方法与荧光免疫测定法的性能相当。Gu0等3 在实验中综合了“一步双单克隆抗体夹心法、低密度蛋白阵列、Au标记Ag增强技术,对心肌钙蛋白Ⅰ (cTnD进行纳米金探针免疫测定。检测过程包括免疫反应和Ag放大两步反应。结果用平板扫描仪或 肉眼观测。整个过程在40mn内完成,而常规EA方法需要3h,两种方法的灵敏度大体相同 NP标记的高灵敏度、磁珠富集分离技术,两者结合可以极大提高检出限。 Manda成功地在 80℃胶乳水介质中合成了FeO3纳米颗粒(约13m),并在其表面镀了金薄层,厚度通过调整反应液成 分控制。Na等开发了一种超灵敏的检测蛋白样品的方法。该系统包括磁微粒表面修饰第一抗 体,(NP表面修饰了条码DNA和第二抗体;有目标蛋白存在时,磁微粒、金纳米探针、目标蛋白形成夹 心结构。复合物经磁场分离,富集的金纳米探针热变性,释放条码DNA,对其进行无PCR或PCR检测 间接检测目标蛋白,检出限分别达到30amol和3amob作为一个例子,他们采用生物条形码方法在 30个人脑脊液中检测了阿尔兹海默病(AD病原标志物(ADDL),而ADDL或其它AD标记物由于在体 91994-2009ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
敏度问题成为技术瓶颈。Francoisa等 [ 22 ]报道了一种新的检测技术 ,直接标记细菌总 RNA,避免了酶放 大的多步反应和可能的偏向性 (如 PCR)。该研究比较了白光光源性能和 2种激光荧光扫描仪检测的 可靠性和灵敏度。结果显示 :纳米颗粒标记的细菌 RNA能产生可重复性的共振光散射信号 ,强度至少 是当前最新的共聚焦荧光信号的 50倍。 W ang等 [ 23 ]开发了一种基于纳米颗粒放大和夹心检测技术的乙肝病毒基因检测芯片 , HBV特异性 探针固定于玻片表面 ,与不同血清样本的 PCR (聚合酶链式反应 )产物杂交 ,杂交信号能容易地可视化 观察。庞代文等 [ 24 ]采用纳米颗粒基因探针的可视化基因检测技术 ,采用“纳米放大 ”和银染色方法 ,对 目标分子夹心杂交进行检测。Ramakrishnan等 [ 25 ]采用金纳米探针结合微阵列技术检测甲氧西林耐药 性金黄色葡萄球菌。以上方法避免了放射性、荧光或目标分子的扩增 (PCR) ,具有简单、快速、灵敏度 高、低成本的特点。 3. 4 表达谱研究 基于微阵列方法的基因表达分析在现代生物学中起了关键作用 ,但目前的微阵列基因表达谱大都 需要反转录将 mRNA转变为标记 cDNA或 cRNA。在 cRNA反转录过程中包括目标放大步骤 ,克服了普 通荧光方法低灵敏度的缺点。Huber等 [ 26 ]报道了一种基于微阵列无酶扩增的基因表达分析系统 ,采用 非扩增的人总 RNA样品作为目标核酸。杂交固定在微阵列表面的 RNA分子通过其 poly2A尾与 oligo2 dT20修饰的 GNP探针杂交 ,信号由自动金相放大 ,然后由纳米颗粒介导的光散射检测。纳米颗粒探针灵 敏度高 ,可用少至 0. 5μg非扩增总 RNA杂交进行基因差异表达分析 ,而不需费时、费力的样品标记。 m iRNA的表达谱研究对于 m iRNA的生物功能研究有重要意义。为避免使用高成本的检测仪器 , Liang等 [ 27 ]在实验中采用了纳米金颗粒探针及 Ag增强方法 ,开发了一种新型的 m iRNA表达谱微阵列。 作者制作了检测 11种来自水稻根、叶的 m iRNA的微阵列模型 ,有很好的实验重现性并与 Northern blot 结果一致。Storhoff等 [ 28 ]用巯基修饰寡核苷酸的 GNP探针 ,检测互补的目标 DNA。玻片表面固定有寡 核苷酸捕获探针 ,用于捕获目标 DNA,之后目标 DNA通过 GNP探针检测。Ag放大后的信号通过简单 的光学系统检测散失波诱导光散射。与 Cy3荧光标记相比 ,该方法的信号增强了 1000倍。可直接检测 微生物的非扩增基因组 DNA,并可检测鉴别人基因组 SNP。 最近 ,DNA微阵列方法被开发用于检测多个基因的甲基化状况。Ji等 [ 29 ]开发了一种 linker2PCR检 测 4种基因的甲基化状况的微阵列。GNP是通过亲和素结合在生物素化的 DNA上的 , Ag +在纳米金颗 粒表面还原沉淀 ,可检测 0. 1 fmol的目标 DNA。实验结果与甲基化特异的 PCR (MSP)和双硫 DNA测序 结果一致。因此它可作为一种价格低廉、有用的灵敏检测工具 ,用于多基因甲基化检测。 3. 5 蛋白质检测 蛋白微阵列杂交可以用许多种方法来检测 ,实用性差 ,难于推广 ,原因是这些方法都需要大型、昂贵 的仪器设备。Han等 [ 30 ]开发出一种基于 GNP标记抗体的简单、便宜的检测方法 ,信号可通过商品化的 办公用桌面平板扫描仪可视化获得。扫描电子显微镜研究显示 :平板扫描仪得到的信号与抗体 2金结合 的表面密度有关 ,平板扫描仪可检测 6 amol的抗体 2金颗粒偶联物。该检测系统用于竞争免疫检测水样 中农药残留代谢物 BAM浓度 ,结果证明金标抗体检测方法与荧光免疫测定法的性能相当。Guo等 [ 31 ] 在实验中综合了“一步 ”双单克隆抗体夹心法、低密度蛋白阵列、Au标记 Ag增强技术 ,对心肌钙蛋白 I ( cTn I)进行纳米金探针免疫测定。检测过程包括免疫反应和 Ag放大两步反应。结果用平板扫描仪或 肉眼观测。整个过程在 40 m in内完成 ,而常规 EL ISA方法需要 3 h,两种方法的灵敏度大体相同。 GNP标记的高灵敏度、磁珠富集分离技术 ,两者结合可以极大提高检出限。Mandal [ 32 ]成功地在 80℃胶乳水介质中合成了 Fe4O3纳米颗粒 (约 13 nm) ,并在其表面镀了金薄层 ,厚度通过调整反应液成 分控制。Nam等 [ 33, 34 ]开发了一种超灵敏的检测蛋白样品的方法。该系统包括 :磁微粒表面修饰第一抗 体 , GNP表面修饰了条码 DNA和第二抗体 ;有目标蛋白存在时 ,磁微粒、金纳米探针、目标蛋白形成夹 心结构。复合物经磁场分离 ,富集的金纳米探针热变性 ,释放条码 DNA,对其进行无 PCR或 PCR检测 , 间接检测目标蛋白 ,检出限分别达到 30 amol和 3 amol。作为一个例子 ,他们采用生物条形码方法在 30个人脑脊液中检测了阿尔兹海默病 (AD)病原标志物 (ADDL) ,而 ADDL或其它 AD标记物由于在体 886 分 析 化 学 第 34卷
逄键涛等:金纳米颗粒聚集以及金纳米探针微阵列技术研究进展 887 内含量很低,传统方法不能检测(<1 pmol/L)。 本课题组采用Au标记Ag增强技术结合微阵列技术,检测了艾滋病病毒的4种抗体13,并开发了 几种便携式读出装置和软件系统。 4总结与展望 微阵列诊断的应用领域将不断拓展,特别是在一些瓶颈问题(如重现性和标准化)得到解决之后 而这些问题主要与现有的荧光标记方法有关,所以任何标记方法的改进都将有益于芯片诊断技术的推 广。如果这些问题得到解决,芯片诊断技术将得到推广并实现更高的并行性检测,其结果是开发出适合 于个人使用、成本更低的检测仪器,并能够从中获得更多的诊断信息。(NP具有高稳定性,可以作为光 学芯片技术开发中的优选方法。它作为稳健的信号系统在前期的基础研究中已得到证明,可能成为仅 次于或相当于荧光标记的标记技术。荧光标记技术已被广泛地长期应用,也比纳米颗粒有自身优势,如 多标记和小分子尺寸。因此,荧光和(NP将会并行采用 除光学检测之外,NP增强的电化学方法也显示了美好的前景。比如,(NP修饰的寡核苷酸与 捕获探针结合后导致导电率变化,据此开发出一种DNA微阵列检测方法。在电极的夹缝内固定捕 获探针,目标分子结合后,(NP处于电极间的缝隙内,Ag在(NP的还原沉淀造成导电率的变化。通过 前后的电阻测定,可检测其杂交信号。这种方法DNA的检出限可达500血mol现在的光学检测装置可 能会被低成本、易集成的微型接触式仪器所替代。另外,表面等离子共振(SPR)M、石英晶体微天平 (QM)1、拉曼共振波以及QNP淬灭荧光检测等方法也有报道 不同尺寸和形状的(NP可能表现出许多新奇的纳米特征。另外,(NP与生物大分子在不同条件下 的相互作用将成为以后的研究趋势。这两个研究领域的进展将产生(NP在生物医疗、生物诊断方面的 应用潜力。(NP以其独特的性质,在纳米科学、微型化分析技术等方面有着越来越多的应用。它的生 物相容性好、标记及检测方法简单,适于开发医学救护现场检测设备。随着对其物理化学性质和纳米介 观效应的深入研究,(NP在生物分子检测领域将具有美好的前景 References Hayat M H Principles and Techn iques of E lectron M icroscopy B iolog ical A pplications, Hayat M H (Ed ) van Nostrand Reinhold. New York. usA 1970 2 HorisbergerM. Scanning Electron M icroscopy Il, 1981:9-31 3 Mirk in C A, Letsinger R L, MucicR C, StrhoffJ J. Natre, 1996, 382(6592):607-609 4 Niemeyer CM. Angew. Chen. Int Edit 2001, 40(22):41284158 5 Elghanian R, Sorhoff JJ, Mucic R C, Letsinger R L, M irk in C A Science, 1997, 277 (22): 1078-1081 6 Sat K, Hosokawa K, Maeda M. Nucleic Acids Res, 2005, 33(1): e4 7 StrhoffJ J. Lucas A D. Garmella V. Bao Y P. mullerur Nat B iotechnol. 20 8 Sonnichsen C, Reinhard B M, L phardt J, Alivisabsa P. Nat B iotechnoI, 2005, 23: 741-745 9LiH, Rothberg L. PNAS,2004,101(39):14036~14039 10 LiH, Rothberg L. J Am. Chen. Soc, 2004, 216: 10958-10961 11 Dykman L A, Bogatyrev V A, Khlebtsov B N, Khlebtsov N G Anal B lochen, 2005, 341: 16-21 14 Moller R, CsakiA, KAhler JM, Fritzsche W. Nucleic Acids Res, 2000, 28(20): e91 15 Peschel S, Ceyhan B, Niemeyer CM, Gao S, ChiL, Smon U. Matr Sci Eng C, 2002, 19: 47- 16 Lack ie PM. Histochen. Cell B iol, 1996. 106: 9-17 17 Festag G, Steinbruck A, Wolf A, Csaki A, M ller R, Fritzsche w. J Floresc, 2005, 15 (2): 161-170 18 Taton T'A, Mirk in C A, Letsinger R L Science 2000, 289: 1757-1760 19 A lexandre L Hamels S, Dufour S. Collet J, Zammatteo n, Longueville F d, Gala J L, Remacle J. Anal B iochen 2001,295:1~8 91994-2009ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
内含量很低 ,传统方法不能检测 ( < 1 pmol/L)。 本课题组采用 Au标记 Ag增强技术结合微阵列技术 ,检测了艾滋病病毒的 4种抗体 [ 35 ] ,并开发了 几种便携式读出装置和软件系统。 4 总结与展望 微阵列诊断的应用领域将不断拓展 ,特别是在一些瓶颈问题 (如重现性和标准化 )得到解决之后。 而这些问题主要与现有的荧光标记方法有关 ,所以任何标记方法的改进都将有益于芯片诊断技术的推 广。如果这些问题得到解决 ,芯片诊断技术将得到推广并实现更高的并行性检测 ,其结果是开发出适合 于个人使用、成本更低的检测仪器 ,并能够从中获得更多的诊断信息。GNP具有高稳定性 ,可以作为光 学芯片技术开发中的优选方法。它作为稳健的信号系统在前期的基础研究中已得到证明 ,可能成为仅 次于或相当于荧光标记的标记技术。荧光标记技术已被广泛地长期应用 ,也比纳米颗粒有自身优势 ,如 多标记和小分子尺寸。因此 ,荧光和 GNP将会并行采用。 除光学检测之外 , GNP增强的电化学方法也显示了美好的前景 [ 36 ]。比如 , GNP修饰的寡核苷酸与 捕获探针结合后导致导电率变化 ,据此开发出一种 DNA微阵列检测方法 [ 37 ]。在电极的夹缝内固定捕 获探针 ,目标分子结合后 , GNP处于电极间的缝隙内 , Ag在 GNP的还原沉淀造成导电率的变化。通过 前后的电阻测定 ,可检测其杂交信号。这种方法 DNA的检出限可达 500 fmol。现在的光学检测装置可 能会被低成本、易集成的微型接触式仪器所替代。另外 ,表面等离子共振 (SPR) [ 38 ]、石英晶体微天平 (QCM) [ 39 ]、拉曼共振波 [ 40 ]以及 GNP淬灭荧光检测 [ 41 ]等方法也有报道。 不同尺寸和形状的 GNP可能表现出许多新奇的纳米特征。另外 , GNP与生物大分子在不同条件下 的相互作用将成为以后的研究趋势。这两个研究领域的进展将产生 GNP在生物医疗、生物诊断方面的 应用潜力。GNP以其独特的性质 ,在纳米科学、微型化分析技术等方面有着越来越多的应用。它的生 物相容性好、标记及检测方法简单 ,适于开发医学救护现场检测设备。随着对其物理化学性质和纳米介 观效应的深入研究 , GNP在生物分子检测领域将具有美好的前景。 References 1 Hayat M H. Principles and Techniques of Electron M icroscopy. B iological Applications, Hayat M H ( Ed. ) van Nostrand Reinhold, New York, USA, 1970 2 HorisbergerM. Scanning Electron M icroscopy Ⅱ, 1981: 9～31 3 M irkin C A, Letsinger R L, Mucic R C, Storhoff J J. N ature, 1996, 382 (6592) : 607～609 4 N iemeyer C M. Angew. Chem. Int. Edit, 2001, 40 (22) : 4128～4158 5 Elghanian R, Storhoff J J, Mucic R C, Letsinger R L, M irkin C A. Science, 1997, 277 (22) : 1078～1081 6 Sato K, Hosokawa K, Maeda M. N ucleic Acids Res. , 2005, 33 (1) : e4 7 Storhoff J J, Lucas A D, Garimella V, Bao Y P, Müller U R. N at. B iotechnol. , 2004, 22: 883～887 8 SÊnnichsen C, Reinhard B M, L iphardt J, A livisatos A P. N at. B iotechnol. , 2005, 23: 741～745 9 L i H, Rothberg L. PNAS , 2004, 101 (39) : 14036～14039 10 L i H, Rothberg L. J. Am. Chem. Soc. , 2004, 216: 10958～10961 11 Dykman L A, Bogatyrev V A, Khlebtsov B N, Khlebtsov N G. Anal. B iochem. , 2005, 341: 16～21 12 CsÀki A, MÊller R, Fritzsche W. Expert Rev. M ol. D iagn. , 2002, 2 (2) : 89～94 13 Hainfeld J F, Powell R D. J. Histochem. Cytochem. , 2000, 48 (4) : 471～480 14 MÊller R, CsÀki A, KÀhler J M, Fritzsche W. N ucleic Acids Res. , 2000, 28 (20) : e91 15 Peschel S, Ceyhan B, N iemeyer C M, Gao S, Chi L, Simon U. M ater Sci. Eng. C, 2002, 19: 47～50 16 Lackie P M. Histochem. Cell. B iol. , 1996, 106: 9～17 17 Festag G, Steinbrück A, Wolff A, Csaki A, M ller R, Fritzsche W. J. Fluoresc. , 2005, 15 (2) : 161～170 18 Taton T A, M irkin C A, Letsinger R L. Science, 2000, 289: 1757～1760 19 A lexandre I, Hamels S, Dufour S, Collet J, Zammatteo N, Longueville F D, Gala J L, Remacle J. Anal. B iochem. , 2001, 295: 1～8 第 6期 逄键涛等 :金纳米颗粒聚集以及金纳米探针 2微阵列技术研究进展 887
分析化学 第34卷 20 Wei Y, Cao C, J in R, Mirkin C A Science, 2002, 297: 15361540 21 Bao Y P, HuberM, Wei T, Marla SS, Strhoff J J, Muller UR Nucleic A cids Res, 2005, 33 (2): e15 22 Francoisa P. Benta M. Vaudauxa P. Schrenzel J.J M icpbiol Meth. 2003. 55: 755-762 J. LIu h 24 Wang Y, Pang D, Zhang Z, Zheng H, Cao J, Shen I J Med VinDI, 2003, 70: 205-211 5 Ramakrishnan R, Buck ingham W, DamanusM, Gieser L, Klein K, Kunkel G, Prokhomva A, R iccelli P. Clin Chen 26 HuberM, Wei T, Muller U R, Lefebvre P A, Marla SS, Bao Y P. Nucleic A cids Res, 2004, 32(18): e137 7 LiangR, Liw, Li Y, Tan C, LiJ, Jin Y, Ruan k Nucleic A cids Res, 2005, 33 (2): el7 28 StonhoffJ J, Marla S S, Bao P, Hagenow S, Mehta H, Lucas A, Garmella V, Patno T, Buck ingham W, Cork W, Muller UR Biasens B ioelectron, 2004. 19: 875-883 29 JiM. Hou P. LiS. Hen. Lu z Clin Chin. Acta. 2004. 342: 145-153 30 Han A, Dufva M, Belleville E, Christensen CB V. Lab Chip, 2003, 3(4): 329-332 31 Guo H, Zhang J, Yang D, Xiao P, He N. Colloid Surface B, 2005, 40: 195-198 32 MandalM, Kundu S, Ghosh S K, Panigrahi S, Sau T K, Yusuf SM, Pal J Colloid In terface Sci, 2005, 286: 187-194 33 Nam J, Thaxton C, Mirkin C A. Science, 2003, 301: 1884-1886 34 Georganopoubu D G, Chang L, Nam J, Thaxton C S, Mufson E J, Klen W L, Mirkin C A PNAS, 2005, 102(7) 2273~2276 35 Pang j ian tao逄键涛), Zhang ili(张敏丽), Wen Siyuan(文思远), W ang Shengqi(升启). Bulletin of the A cadeny fM ilitary M ical Sciences((军事医学科学院院刊),2005,29(3):223~226 36 Yarez-Sedep P. Pingarron J. Anal B ional Chen. 2005. 382: 884--886 37 Park S. Tatn TA. Mirkin C A Science. 2002. 295: 1503-1506 38 Mitchell JS, Wu Y, Cook C J, Main L Anal B lochen, 2005, 343: 125-135 39 Liu T, Tang J, J iang L B lochen. B iophys Conn 40 A slan K, Lakow icz J R, Geddes C D. Anal B lochan, 2004, 330: 145-155 41 Dubertret B. Cakme M. L ibchabera. Nat B iotechnoI. 2001. 19: 365-370 D eve lopm en t of the a ggrega tion of Gold Nan particles and Nanoprobe M icroarrays Technolog ies Pang j antao, wen Siyuan, W ang sheng r Institute of Radiation Med icine, A caden y of M ilitary M ed ical Sciences Beijing 100850) A bstract Gold nanoparticle(GNP) probes have abused more and more interest recently. Here we review the app lication and advancement of gnP p robes in bpassay, which focuses on the aggregation of GNP and m ic array de tecton The concemed electrochem ical and other methods have also been discussed 41 papers ware cited Keywords Gold nanopartic le, m ic marray, bioassay, review (Receied 10 August 2005: accep ted 3 December 2005) g1994-2009ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
20 W ei Y, Cao C, Jin R, M irkin C A. Science, 2002, 297: 1536～1540 21 Bao Y P, HuberM, W ei T, Marla S S, Storhoff J J, Müller U R. N ucleic Acids Res. , 2005, 33 (2) : e15 22 Francoisa P, Bentoa M, Vaudauxa P, Schrenzel J. J. M icrobiol. M eth. , 2003, 55: 755～762 23 W ang Y, Shen J, L iu H. J. V irolM ethods, 2004, 121: 79～84 24 W ang Y, Pang D, Zhang Z, Zheng H, Cao J, Shen J. J. M ed. V irol. , 2003, 70: 205～211 25 Ramakrishnan R, Buckingham W , DomanusM, Gieser L, Klein K, Kunkel G, Prokhorova A, Riccelli P. Clin. Chem. , 2004, 50 (10) : 1949～1952 26 HuberM, W ei T, Müller U R, Lefebvre P A, Marla S S, Bao Y P. N ucleic Acids Res. , 2004, 32 (18) : e137 27 L iang R, L iW , L i Y, Tan C, L i J, Jin Y, Ruan K. N ucleic Acids Res. , 2005, 33 (2) : e17 28 Storhoff J J, Marla S S, Bao P, Hagenow S, Mehta H, Lucas A, Garimella V, Patno T, Buckingham W , Cork W , Müller U R. B iosens. B ioelectron. , 2004, 19: 875～883 29 JiM, Hou P, L i S, He N , Lu Z. Clin. Chim. Acta, 2004, 342: 145～153 30 Han A, Dufva M, Belleville E, Christensen C B V. Lab. Chip. , 2003, 3 (4) : 329～332 31 Guo H, Zhang J, Yang D, Xiao P, He N. Colloid Surface B , 2005, 40: 195～198 32 MandalM, Kundu S, Ghosh S K, Panigrahi S, Sau T K, Yusuf SM, Pal. J. Colloid Interface Sci. , 2005, 286: 187～194 33 Nam J, Thaxton C, M irkin C A. Science, 2003, 301: 1884～1886 34 Georganopoulou D G, Chang L, Nam J, Thaxton C S, Mufson E J, Klein W L, M irkin C A. PNAS , 2005, 102 ( 7) : 2273～2276 35 Pang Jiantao (逄键涛 ) , ZhangM inli(张敏丽 ) ,W en Siyuan (文思远 ) , W ang Shengqi(王升启 ). B ulletin of the Academ y of M ilitary M edical Sciences(军事医学科学院院刊 ) , 2005, 29 (3) : 223～226 36 YáÌez2SedeÌo P, Pingarrón J. Anal. B ioanal. Chem. , 2005, 382: 884～886 37 Park S, Taton T A, M irkin C A. Science, 2002, 295: 1503～1506 38 M itchell J S, W u Y, Cook C J, Main L. Anal. B iochem. , 2005, 343: 125～135 39 L iu T, Tang J, Jiang L. B iochem. B iophys. Comm un. , 2004, 313: 3～7 40 A slan K, Lakowicz J R, Geddes C D. Anal. B iochem. , 2004, 330: 145～155 41 Dubertret B, Calame M, L ibchaber A J. N at. B iotechnol. , 2001, 19: 365～370 D evelopm en t of the Aggrega tion of Gold Nanoparticles and Nanoprobe2M icroarrays Technolog ies Pang Jiantao, W en Siyuan, W ang Shengqi 3 ( Institute of Radiation M edicine, Academ y of M ilitary M edical Sciences, B eijing 100850) Abstract Gold nanoparticle ( GNP) p robes have aroused more and more interest recently. Here we review the app lication and advancement of GNP p robes in bioassay, which focuses on the aggregation of GNP and m icroarray detection. The concerned electrochem ical and other methods have also been discussed. 41 papers ware cited. Keywords Gold nanoparticle, m icroarray, bioassay, review (Received 10 August 2005; accep ted 3 December 2005) 888 分 析 化 学 第 34卷
