第六章 食品安全现代生物检测技术 第一节 免疫学检测技术 第二节 PCR检测技术 第三节 转基因食品的检测技术
第六章 食品安全现代生物检测技术 第一节 免疫学检测技术 第二节 PCR检测技术 第三节 转基因食品的检测技术
• 第一节 免疫学检测技术 • 一、概述 • 抗原与抗体的结合反应是一切免疫测定技术的最基本原理。 在此基础上结合一些生化或理化方法作为信号显示或放大系统 即可建立免疫测定法，如放射免疫测定法、酶免疫测定法、荧 光免疫测定法等。一个成功的免疫测定法必须具备3个要素： 性能优良的抗体、灵敏和专一性的标记物和高效的分离手段。 按照是否使用标记物分为标记免疫测定法和非标记免疫测定法， 后者又称为经典免疫测定法；按反应介质分为均相或非均相(免 疫复合物需分离后检测)免疫测定法；按反应状态分为平衡态或 非平衡态免疫测定法。按照标记物种类，标记免疫测定法又分 为放射性标记测定法和非放射性标记测定法
• 第一节 免疫学检测技术 • 一、概述 • 抗原与抗体的结合反应是一切免疫测定技术的最基本原理。 在此基础上结合一些生化或理化方法作为信号显示或放大系统 即可建立免疫测定法，如放射免疫测定法、酶免疫测定法、荧 光免疫测定法等。一个成功的免疫测定法必须具备3个要素： 性能优良的抗体、灵敏和专一性的标记物和高效的分离手段。 按照是否使用标记物分为标记免疫测定法和非标记免疫测定法， 后者又称为经典免疫测定法；按反应介质分为均相或非均相(免 疫复合物需分离后检测)免疫测定法；按反应状态分为平衡态或 非平衡态免疫测定法。按照标记物种类，标记免疫测定法又分 为放射性标记测定法和非放射性标记测定法
• 目前最常用的免疫学检测技术如下： • （1）放射免疫测定技术 • （2）酶免疫测定技术 • （3）荧光免疫测定技术 • （4）发光免疫测定技术 • （5）胶体金免疫测定技术
• 目前最常用的免疫学检测技术如下： • （1）放射免疫测定技术 • （2）酶免疫测定技术 • （3）荧光免疫测定技术 • （4）发光免疫测定技术 • （5）胶体金免疫测定技术
• 二、酶联免疫吸附试验(ELISA) • （一）ELISA的基本原理 • ELISA(Enzyme-Linked immunosorbent assay)的基础是抗原 或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。这一方法的基本原理如 下。 • （1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，井保持其免 疫活性； • （2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种 酶标抗原或抗体既保留其免疫活性．又保留酶的活性。 • （二）ELISA的类型 • ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。用于临床检验 的ELISA主要有以下几种类型。 • 1 双抗体夹心法测抗原 • 2 双抗原夹心法测抗体 • 3 间接法测抗体 • 4 竞争法测抗体 • 5 竞争法测抗原
• 二、酶联免疫吸附试验(ELISA) • （一）ELISA的基本原理 • ELISA(Enzyme-Linked immunosorbent assay)的基础是抗原 或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。这一方法的基本原理如 下。 • （1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，井保持其免 疫活性； • （2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种 酶标抗原或抗体既保留其免疫活性．又保留酶的活性。 • （二）ELISA的类型 • ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。用于临床检验 的ELISA主要有以下几种类型。 • 1 双抗体夹心法测抗原 • 2 双抗原夹心法测抗体 • 3 间接法测抗体 • 4 竞争法测抗体 • 5 竞争法测抗原
• （三）ELISA的材料与试剂 • 完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：已包被抗 原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；酶标记的抗原 或抗体（结合物）；酶的底物；阴性对照品和阳性对 照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量 测定中）；结合物及标本的稀释液；洗涤液；酶反应 终止液。 • 1 免疫吸附剂 • 2 结合物 • 3 酶的底物 • 4 洗涤液 • 5 酶反应终止液 • 6 阳性对照品和阴性对照品 • 7 参考标准品
• （三）ELISA的材料与试剂 • 完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：已包被抗 原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；酶标记的抗原 或抗体（结合物）；酶的底物；阴性对照品和阳性对 照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量 测定中）；结合物及标本的稀释液；洗涤液；酶反应 终止液。 • 1 免疫吸附剂 • 2 结合物 • 3 酶的底物 • 4 洗涤液 • 5 酶反应终止液 • 6 阳性对照品和阴性对照品 • 7 参考标准品
• 三、磺胺二甲嘧啶的间接竞争ELISA检测 • （一）人工完全抗原的合成 • （二）合成抗原的鉴定 • （三）抗体的制备与纯化 • （四）标准竞争抑制曲线的制作 • （五）畜产品中SM2残留的ELISA检测 • （六）方法评价 • 1 特异性 • 2 灵敏度 • 3 准确度 • 4 精确度
• 三、磺胺二甲嘧啶的间接竞争ELISA检测 • （一）人工完全抗原的合成 • （二）合成抗原的鉴定 • （三）抗体的制备与纯化 • （四）标准竞争抑制曲线的制作 • （五）畜产品中SM2残留的ELISA检测 • （六）方法评价 • 1 特异性 • 2 灵敏度 • 3 准确度 • 4 精确度
• 第二节PCR检测技术 • 一、概述 • PCR又称聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)，是 1985年由美国的Kary Mullis首创并由美国Cetus公司开发的一 项体外扩增DNA的方法。应用该方法可使极微量的特定DNA片 段在几小时内迅速扩增至百万倍，因而一经问世便在短短的数 年内就得到了迅速发晨和实际应用，并在原有基础上结合各种 生化分子生物学技术衍生出了许多改良技术。这些技术显示出 了巨大的潜力，发挥着越来越大的作用，也正因为如此它们被 誉为20世纪80年代分子生物学革命和生物技术的飞跃。 • （一）PCR原理 • PCR是依据DNA模板的特性，模仿体内的复制过程，在体 外合适的条件下以单链DNA为模板，以人工设计和合成的寡核 苷酸为引物，利用热稳定的DNA聚合酶延5’-3’方向掺人单核苷 酸来特异性的扩增DNA片段的技术。 • （二）PCR反应体系 • PCR反应体系主要由引物、dNTP、DNA聚合酶(TaqDNA 聚合酶)、缓冲液、Mg2+和核酸模板组成
• 第二节PCR检测技术 • 一、概述 • PCR又称聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)，是 1985年由美国的Kary Mullis首创并由美国Cetus公司开发的一 项体外扩增DNA的方法。应用该方法可使极微量的特定DNA片 段在几小时内迅速扩增至百万倍，因而一经问世便在短短的数 年内就得到了迅速发晨和实际应用，并在原有基础上结合各种 生化分子生物学技术衍生出了许多改良技术。这些技术显示出 了巨大的潜力，发挥着越来越大的作用，也正因为如此它们被 誉为20世纪80年代分子生物学革命和生物技术的飞跃。 • （一）PCR原理 • PCR是依据DNA模板的特性，模仿体内的复制过程，在体 外合适的条件下以单链DNA为模板，以人工设计和合成的寡核 苷酸为引物，利用热稳定的DNA聚合酶延5’-3’方向掺人单核苷 酸来特异性的扩增DNA片段的技术。 • （二）PCR反应体系 • PCR反应体系主要由引物、dNTP、DNA聚合酶(TaqDNA 聚合酶)、缓冲液、Mg2+和核酸模板组成
• （三）PCR反应参数 • 在PCR反应中每轮循环的各步反应时间不应过长，以免降低TaqDNA 聚合酶的活性。下面介绍PCR反应中的一些具体参数。 • 1.变性 • 2.退火 • 3.延伸 • 4.循环次数 • （四）常见的PCR种类 • 1.热启动PCR • 2.一步单管PCR • 3.多重PCR • 4.依赖PCR的DNA指纹图谱技术 • 5.PCR-单链构想多态性分析 • 6.mRNA差异显示技术 • 7.随机引物扩增DNA多态性（RAPD） • 8.以微卫星DNA介导的PCR技术 • 9.基因间重复性回文片段（REP）和基因内重复性一致序列（ERIC）的 扩增 • 10.扩增片段长度多态性分析（AFLP） • 11.限制性长度多态性分析（RFLP） • 12.用于RNA病毒检测的核酸扩增技术
• （三）PCR反应参数 • 在PCR反应中每轮循环的各步反应时间不应过长，以免降低TaqDNA 聚合酶的活性。下面介绍PCR反应中的一些具体参数。 • 1.变性 • 2.退火 • 3.延伸 • 4.循环次数 • （四）常见的PCR种类 • 1.热启动PCR • 2.一步单管PCR • 3.多重PCR • 4.依赖PCR的DNA指纹图谱技术 • 5.PCR-单链构想多态性分析 • 6.mRNA差异显示技术 • 7.随机引物扩增DNA多态性（RAPD） • 8.以微卫星DNA介导的PCR技术 • 9.基因间重复性回文片段（REP）和基因内重复性一致序列（ERIC）的 扩增 • 10.扩增片段长度多态性分析（AFLP） • 11.限制性长度多态性分析（RFLP） • 12.用于RNA病毒检测的核酸扩增技术
• （五）PCR技术用于检测的主要步骤 • （1）运用化学手段对目标DNA进行提取。 • （2）设计并合成引物，引物设计或合成的好坏直接决定PCR 扩增的成效。 • （3）进行PCR扩增。 • （4）克隆并筛选鉴定PCR产物，将扩增产物进行电泳、染色， 在紫外光照射下可见扩增特异区段的DNA带．根据该带的不同 即可鉴定不同的DNA。 • （5）DNA序列分析
• （五）PCR技术用于检测的主要步骤 • （1）运用化学手段对目标DNA进行提取。 • （2）设计并合成引物，引物设计或合成的好坏直接决定PCR 扩增的成效。 • （3）进行PCR扩增。 • （4）克隆并筛选鉴定PCR产物，将扩增产物进行电泳、染色， 在紫外光照射下可见扩增特异区段的DNA带．根据该带的不同 即可鉴定不同的DNA。 • （5）DNA序列分析
• 第三节 转基因食品的检测技术 • 一、概述 • 转基因食品又称遗传修饰食品（genetically modified food）， 简称GMF或GM食品。转基因食品大体上分为如下三类。 • （1）转基因植物食品 由转基因植物如转基因的玉米、大豆、水 稻、马铃薯、番茄、香蕉、苹果、菠菜等生产加工而成。 • （2）转基因动物食品 如转基因的鱼、鸡、牛、羊等。目的主要 通过导入外源基因或对自身基因加以修饰来使受体动物降低结缔 组织交联度、改善肉质．或使受体生物个体肥大，或生产营养价 值高的蛋、肉、乳等。 • （3）转基因微生物食品 如转基因微生物发酵而制得的葡萄酒、 啤酒、酱油等，此类食品是利用转基因微生物（如转基因酵母和 酶）的作用而生产出来的食品。后两类转基因食品目前在市场上 还很少
• 第三节 转基因食品的检测技术 • 一、概述 • 转基因食品又称遗传修饰食品（genetically modified food）， 简称GMF或GM食品。转基因食品大体上分为如下三类。 • （1）转基因植物食品 由转基因植物如转基因的玉米、大豆、水 稻、马铃薯、番茄、香蕉、苹果、菠菜等生产加工而成。 • （2）转基因动物食品 如转基因的鱼、鸡、牛、羊等。目的主要 通过导入外源基因或对自身基因加以修饰来使受体动物降低结缔 组织交联度、改善肉质．或使受体生物个体肥大，或生产营养价 值高的蛋、肉、乳等。 • （3）转基因微生物食品 如转基因微生物发酵而制得的葡萄酒、 啤酒、酱油等，此类食品是利用转基因微生物（如转基因酵母和 酶）的作用而生产出来的食品。后两类转基因食品目前在市场上 还很少