华东师范大学：《植物生理学》课程教学资源（实验）探究性实验研究方案（二）探究土壤酸碱度对蚕豆幼苗的生理生化影响的鉴定.doc_大学文库

探究土壤酸碱度对蚕豆幼苗的生理生化影响的鉴定王铭明10071920231张良10071910222 摘土壤的酸碱度用門值表示,是影响蔬菜生长的重要因素,因此了解土壤的酸碱度对蔬菜生长的影响,掌握简便测定土壤的酸碱度的方法,有针对性地针对不同的蔬菜品种因地制宜地研究栽培对策,对蔬菜种植特别是保护地生产蔬菜有重要意义。随着国家测土配方施肥行动的开展,人们对测土配方施肥的认识也越来越高。但是很多人把测土配方施肥只看作是养分的调整,或者只是氮、磷、钾的调整,这是很不够的,也是片面的。在推行测土配方施肥过程中我们发现,即使氮、磷、钾配比很合理,但是土壤ph值低于5或大于8作物生长仍会受到严重的伤害表1 土壤pH值调查结果 H值测试用户百分比 (户)(%) 作物生长状况 0.05作物严重伤害,几乎绝产 ≥4~4.5 000.87作物受到严重伤害 >4.5~510964.47多数作物受到严重伤害 >5~5.5275211.91多数作物受到伤害 >5.5~6371916.1多数作物生长受阻 >6~6.5630827.31作物生长正常 >6.5~7630927.31作物生长正常大部分作物适宜生长,部分 >7.0~7.5235810.21 作物生长受阻,受到伤害 >7.5~8.03161.37作物生长受到伤害 >8 29 0.12作物生长受到严重伤害本文探究了情况酸碱度与植物生长的相互关联,主要研究不同情况酸碱度对蚕豆的影响。并分析表观形态、根系活力、光和强度、硝酸还原酶与土壤酸碱度的关联。蚕豆在世界范围内种植面积高达200万公顷,是比较有代表性的植物,近20年来对蚕豆的研究也较多。蚕豆具有适应性广和固氮量高的特点,有利于对其矿物元素的吸取和N得吸收的指标的鉴定,同时也方便进行光和强度和表观形态指标的测定。这是我们选取蚕豆作为研究对象的原因二、实验材料:蚕豆种子或幼苗实验器材: ①用形态学方法测定植株生长状况:标尺等测量工具 ②测定土壤或溶液酸碱度:测定酸碱度的仪器,一般用简易电子PH测试计、PH

石蕊试纸等 ③a-萘胺氧化法测定根系活力的测定:分光光度计,分析天平,烘箱,50m三角烧瓶x2,量筒ⅹ4,移液管x4,容量瓶κ2,烧杯、试管多个 ④活体法测定硝酸还原酶活性:分光光度计,真空泵(或注射器),温箱,天平真空干燥器,50m三角烧瓶x2,钻孔器,烧杯、试管多个 ⑤便携式光和测定仪法测定植物光和强度: ECA-PB04025光和测定仪四、实验试剂: ①a-萘胺氧化法测定根系活力的测定 α-萘胺溶液1(称取10mgα-萘胺,先用2ml左右的95%乙醇溶解,然后加水到 200m1,成为50μg/ml的溶液,取150ml该溶液再加水150m1稀释成25μg/ml的 α-萘胺溶液),0.lmol/LpH7.0的磷酸缓冲液(配制储备液A:0.2mol/L磷酸ˉ 氢钠,储备液B:0.2mol几L磷酸氢二钠,A液39.0ml,B液61.0ml,稀释至200m1), 1%对氨基苯磺酸(将1g对氨基苯磺酸溶解于100ml30%醋酸溶液当中),亚硝酸钠溶液(称10mg亚硝酸钠溶于100ml水中)。 ②活体法测定硝酸还原酶活性: α-萘胺溶液2(称取0.2gα-萘胺,先用1ml浓盐酸的蒸馏水中,然后加水到 l00m1),0.lmol/LpH7.5的磷酸缓冲液(配制储备液A:0.2mol/L磷酸二氢钠, 储备液B:0.2mol/L磷酸氢二钠,A液16.0ml,B液84.0ml,稀释至200m1),0.2mol/L 硝酸钾溶液(溶解Σ0.22g硝酸钾于100oul蒸馏水中),磺胺试剂(g磺胺加25m 浓盐酸,用蒸馏水稀释至0m1),亚硝酸钠标准溶液(lg亚硝酸钠用蒸馏水溶解成1000ml。然后吸取5ml,再加蒸馏水稀释成1000ml,此溶液含亚硝酸钠5μg/ml 用时稀释) ③配制不同的p的培养液:各种盐类,λNaCl,KCl,碳酸氢钠,磷酸一氢钾,磷酸二氢钾,HCl,NaOH,植物激素等五、试验方法 ①蚕豆培养土壤种植,快速培育,再将豆苗移栽,长成一定程度的植株,实验备用。 ②在离体培养的培养基中设置不同的酸碱梯度,PH=5、6.5、8三个梯度进行育种。在经过一定时间后视察纪录(其中可能会有不同程度的筛选) ③用酸度计法测定pH ④用形态学方法测定植株生长状况,包括高矮,颜色等等指标; ⑤用通过测定a-萘胺的氧化能力的方法来测定根系活力 ⑥用磺胺比色法测定硝酸还原酶的活性; ⑦通过便携式光合测定仪测定光和强度。试验进度安排: 1)10.22-115两周时间育种,长出幼苗,期间定期观察测出一些指标 2)1161.20移栽长出真叶,期间定期观察测出一些指标 3)11.21-11.30测出实验指标; 4)121-1210写出报告七、实验步骤 1)育种蚕豆在4x8种植盘内装入新鲜泥土,每个孔种植2枚蚕豆种子,共种植4个盘子即一共有256枚种子。我们先用温水,也就是30度的水将种子泡了两个小时,然

石蕊试纸等 ③ α-萘胺氧化法测定根系活力的测定：分光光度计，分析天平，烘箱，50ml 三角烧瓶 x2,量筒 x4,移液管 x4，容量瓶 x2，烧杯、试管多个 ④ 活体法测定硝酸还原酶活性：分光光度计，真空泵（或注射器），温箱，天平，真空干燥器，50ml 三角烧瓶 x2，钻孔器，烧杯、试管多个 ⑤ 便携式光和测定仪法测定植物光和强度：ECA-PB04025 光和测定仪四、实验试剂： ① α-萘胺氧化法测定根系活力的测定： α-萘胺溶液 1（称取 10mgα-萘胺，先用 2ml 左右的 95%乙醇溶解，然后加水到 200ml，成为 50μg/ml 的溶液，取 150ml 该溶液再加水 150ml 稀释成 25μg/ml 的 α-萘胺溶液），0.1mol/L pH7.0 的磷酸缓冲液（配制储备液 A：0.2mol/L 磷酸二氢钠，储备液 B：0.2mol/L 磷酸氢二钠，A 液 39.0ml，B 液 61.0ml，稀释至 200ml）， 1%对氨基苯磺酸（将 1g 对氨基苯磺酸溶解于 100ml30%醋酸溶液当中），亚硝酸钠溶液（称 10mg 亚硝酸钠溶于 100ml 水中）。 ② 活体法测定硝酸还原酶活性： α-萘胺溶液 2（称取 0.2gα-萘胺，先用 1ml 浓盐酸的蒸馏水中，然后加水到 100ml），0.1mol/L pH7.5 的磷酸缓冲液（配制储备液 A：0.2mol/L 磷酸二氢钠，储备液 B：0.2mol/L 磷酸氢二钠，A 液 16.0ml，B 液 84.0ml，稀释至 200ml），0.2mol/L 硝酸钾溶液（溶解 20.22g 硝酸钾于 1000ml 蒸馏水中），磺胺试剂（1g 磺胺加 25ml 浓盐酸，用蒸馏水稀释至 100ml），亚硝酸钠标准溶液（1g 亚硝酸钠用蒸馏水溶解成 1000ml。然后吸取 5ml，再加蒸馏水稀释成 1000ml，此溶液含亚硝酸钠 5μg/ml，用时稀释） ③ 配制不同的 pH 的培养液：各种盐类，入 NaCl，KCl，碳酸氢钠，磷酸一氢钾，磷酸二氢钾，HCl，NaOH，植物激素等五、试验方法： ① 蚕豆培养：土壤种植，快速培育，再将豆苗移栽，长成一定程度的植株，实验备用。 ②在离体培养的培养基中设置不同的酸碱梯度，PH= 5 、6.5、 8 三个梯度进行育种。在经过一定时间后视察纪录（其中可能会有不同程度的筛选） ③用酸度计法测定 pH； ④用形态学方法测定植株生长状况，包括高矮，颜色等等指标； ⑤用通过测定 a-萘胺的氧化能力的方法来测定根系活力； ⑥用磺胺比色法测定硝酸还原酶的活性； ⑦通过便携式光合测定仪测定光和强度。六、试验进度安排： 1）10.22-11.5 两周时间育种，长出幼苗，期间定期观察测出一些指标； 2）11.6-11.20 移栽长出真叶，期间定期观察测出一些指标； 3）11.21-11.30 测出实验指标； 4）12.1-12.10 写出报告。七、实验步骤： 1）育种蚕豆：在 4x8 种植盘内装入新鲜泥土，每个孔种植 2 枚蚕豆种子，共种植 4 个盘子，即一共有 256 枚种子。我们先用温水，也就是 30 度的水将种子泡了两个小时，然

后又用高锰酸钾溶液泡种子15分钟,为种子消毒,将种子从高猛酸钾溶液中捞出, 种眼朝下放在早已经准备好的有土的孔中。按时浇水,保持温度和适时光照,使其发芽。然后移栽,进一步得到有真叶的植株,并设置酸碱梯度为pH=5、6.5、8,每个梯度30个,每个pH设置10个平行样。 2)不同时间段蚕豆植株表观形态变化的测定: 在植株生长的时期定时测量植株表观形态变化,包括高度,色泽,健康程度等指标 3)不同时间段蚕豆植株根系活力的测定 (1)定性观察将洗净的植株根系浸入盛有25ug/ml的a-萘胺溶液的容器中,容器外用黑纸包裹, 静置24——36小时候观察水稻根系的着色状况。着色深者,其根系活力较着色潜者大 (2)定量测定: aa-萘胺含量的测定:称取12g洗净的根系放在100m三角烧瓶中。然后加50ug/ml 的a-萘胺溶液与pH=7.0磷酸缓冲液等量混合液5σm,轻轻振荡,静置1mi,吸取2ml 测定a萘胺的含量,作为实验开始时的数据 b.a-萘胺含量的测定:吸取2ml待测液,加入10m蒸馏水,再在其中加入1%对氨基苯磺酸1m和亚硝酸钠溶液1m,再用蒸馏水定容到25m。在20-60min内510nm 处比色,读取o.D值,在标准曲线上查得相应的a-萘胺含量。从实验开始10min时的数据减去自动氧化的数值,即为溶液中所有的a-萘胺量以ug/(gh)表示。还应将根系烘干称其干重。 c绘制a-萘胺标准曲线:取50ug/m的a-萘胺溶液,配制成50、45、40、35、30、 25、20、15、10、5ug/m的系列溶液,以o.D值为纵坐标,a-萘胺含量为横坐标,绘制标准曲线 4)不同时间段蚕豆植株硝酸还原酶的测定(以离体法为例): (1)酶的提取: 称取0.5g洗净的材料放于研钵中,冷冻30min。然后加入适量石英砂和提取液2ml 磨成匀浆。匀浆用二层纱布过滤,在0-4度,4000r/min冷冻离心20min,得到的上清液即为酶的粗提液。 (2)亚硝酸根含量测定:吸取酶的粗提液0.2m于一试管中,加入0.5ml硝酸钾溶液, 0.3mNAD,混合后在25度保温30min。保温结束后立即加入磺胺试剂2m及a萘胺试剂2m1,混合摇匀,用分光光度计进行比色测定,并以每小时每g鲜重产生的亚硝酸根表示酶活力。 (3)标准曲线的制作:吸取不同浓度的亚硝酸钠溶液,于试管中,依照梯度绘制O.D- 质量浓度曲线。 5)不同时间段蚕豆植株光合作用强度的测定 (1)准备:打开主机前后面板上的电源、气泵开关,打开前面板的开关ON。按照屏幕提示,按数字键选择一一中英文菜单、数据保存、用户设置、测量方式(默认单叶闭路)等内容 (2)核对测量参数:系统容积为测量系统的空气容积,包括叶室、气管及内部测量系统的容积,本系统标称为0.25L;间隔时间为系统内部自动采集的间隔时间,如C3作物,设为3s:C4作物,设为25:作物叶子在叶室夹紧后见光部分的面积为测定面积

后又用高锰酸钾溶液泡种子 15 分钟，为种子消毒，将种子从高猛酸钾溶液中捞出，种眼朝下放在早已经准备好的有土的孔中。按时浇水，保持温度和适时光照，使其发芽。然后移栽，进一步得到有真叶的植株，并设置酸碱梯度为 pH=5、6.5、8，每个梯度 30 个，每个 pH 设置 10 个平行样。 2）不同时间段蚕豆植株表观形态变化的测定：在植株生长的时期定时测量植株表观形态变化，包括高度，色泽，健康程度等指标。 3）不同时间段蚕豆植株根系活力的测定：（1）定性观察：将洗净的植株根系浸入盛有 25ug/ml 的 a-萘胺溶液的容器中，容器外用黑纸包裹，静置 24——36 小时候观察水稻根系的着色状况。着色深者，其根系活力较着色潜者大。（2）定量测定： a.a-萘胺含量的测定：称取1-2g 洗净的根系放在100ml三角烧瓶中。然后加50ug/ml 的 a-萘胺溶液与 pH=7.0 磷酸缓冲液等量混合液 50ml，轻轻振荡，静置 10min，吸取 2ml 测定 a-萘胺的含量，，作为实验开始时的数据。 b.a-萘胺含量的测定：吸取 2ml 待测液，加入 10ml 蒸馏水，再在其中加入 1%对氨基苯磺酸 1ml 和亚硝酸钠溶液 1ml，再用蒸馏水定容到 25ml。在 20-60min 内 510nm 处比色，读取 O.D 值，在标准曲线上查得相应的 a-萘胺含量。从实验开始 10min 时的数据减去自动氧化的数值，即为溶液中所有的 a-萘胺量以 ug/（g.h）表示。还应将根系烘干称其干重。 c.绘制 a-萘胺标准曲线：取 50ug/ml 的 a-萘胺溶液，配制成 50、45、40、35、30、 25、20、15、10、5ug/ml 的系列溶液，以 O.D 值为纵坐标，a-萘胺含量为横坐标，绘制标准曲线。 4）不同时间段蚕豆植株硝酸还原酶的测定（以离体法为例）： (1) 酶的提取：称取 0.5g 洗净的材料放于研钵中，冷冻 30min。然后加入适量石英砂和提取液 2ml，磨成匀浆。匀浆用二层纱布过滤，在 0-4 度，4000r/min 冷冻离心 20min，得到的上清液即为酶的粗提液。 (2)亚硝酸根含量测定：吸取酶的粗提液 0.2ml 于一试管中，加入 0.5ml 硝酸钾溶液， 0.3mlNADH，混合后在 25 度保温 30min。保温结束后立即加入磺胺试剂 2ml 及 a-萘胺试剂 2ml，混合摇匀，用分光光度计进行比色测定，并以每小时每 g 鲜重产生的亚硝酸根表示酶活力。（3）标准曲线的制作：吸取不同浓度的亚硝酸钠溶液，于试管中，依照梯度绘制 O.D- 质量浓度曲线。 5）不同时间段蚕豆植株光合作用强度的测定：（1）准备：打开主机前后面板上的电源、气泵开关，打开前面板的开关 ON。按照屏幕提示，按数字键选择——中英文菜单、数据保存、用户设置、测量方式（默认单叶闭路）等内容。（2）核对测量参数：系统容积为测量系统的空气容积，包括叶室、气管及内部测量系统的容积，本系统标称为 0.25 L；间隔时间为系统内部自动采集的间隔时间，如 C3 作物，设为 3s；C4 作物，设为 2s；作物叶子在叶室夹紧后见光部分的面积为测定面积