∝-淀粉酶与β-淀粉酶活力的测定 【实验原理】 淀粉酶( amylase)包括几种催化特点不同的成员,其中α-淀粉酶随机地作用于淀粉的α-1, 4糖苷键,生成麦芽糖和糊精,β一淀粉酶作用于淀粉非还原端的α-1,4糖苷键,每次从淀粉的非还 原端切下一分子麦芽糖,又被称为糖化酶;葡萄糖淀粉酶则从淀粉的非还原端每次切下一个葡萄 糖。淀粉酶产生的这些还原糖能使3,5一二硝基水杨酸还原,生成棕红色的3一氨基一5一硝基水杨 酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。可以用麦芽糖制作标准曲线,用比色法测定淀 粉生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。几乎所有植物 中都存在有淀粉酶,特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强,主要是α一和β一淀粉酶。α一淀 粉酶不耐酸,在pH36以下迅速钝化;而β一淀粉酶不耐热,在70℃15min则被钝化。根据它们的这 种特性,在测定时可先测定淀粉酶的总活力(α+β),然后钝化其中之一,就可测出另一个的活 力。本实验采用加热钝化β一淀粉酶测定α一淀粉酶的活力,再与非钝化条件下总的酶活力比较,求 出β一淀粉酶的活力。 【器材与试剂】 1.实验仪器分光光度计,恒温水浴,离心机,具塞刻度试管,刻度吸管,容量瓶。 2.实验试剂标准麦芽糖溶液(100μg/mL)(精确称取100mg麦芽糖,用蒸馏水溶解并定容 至100mL,取其中10mL,用蒸馏水定容至100mL),3,5-二硝基水杨酸试剂(精确称取1g3, 5—二硝基水杨酸,溶于20mL2mo/ L Naoh溶液中,加入50mL蒸馏水,再加入30g酒石酸钾 钠,待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞,勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用) 0.1mo/LpH5.6的柠檬酸缓冲液(见附录表2),1%淀粉溶液(称取1g淀粉溶于100mL0.1 mo/LpH5.6的柠檬酸缓冲液中),0.4 mol/L NaOH溶液 3.实验材料萌发的小麦种子 【实验步骤】 1.粗酶液制备:称取1.0g萌发2-3天的小麦种子,置研钵中加1mL蒸馏水和少量石英砂,研磨 成匀浆后转入离心管中,用5mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管,提取液在室温下放置浸提15~20 min,期间摇动使其充分提取。然后在3000r/min转速下离心10min,将上清液倒入50mL容量瓶 中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶原液。吸取淀粉酶原液1mL,放λ50mL容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度摇匀,即为淀粉酶稀释液 2.绘制麦芽糖标准曲线:取7支干净的具塞刻度试管,编号1-7,将标准麦芽糖溶液(100 μg/mL)按照下表稀释成0-100gmL的标准液(0、10、20、40、60、80、100μg/mL)(表 5-4),每管依次加入3,5-二硝基水杨酸2mL,摇匀,置沸水浴中煮沸5min,取出后流水冷却, 以1号管作为空白调零点,在540m波长下比色测定。以麦芽糖浓度为横座标,吸光度值为纵坐 标,绘制标准曲线或建立回归方程。 表5-4标准麦芽糖溶液配制
Ⅰ α-淀粉酶与β-淀粉酶活力的测定 【实验原理】 淀粉酶（amylase）包括几种催化特点不同的成员，其中α－淀粉酶随机地作用于淀粉的α-1, 4糖苷键，生成麦芽糖和糊精，β－淀粉酶作用于淀粉非还原端的α-1, 4糖苷键，每次从淀粉的非还 原端切下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶；葡萄糖淀粉酶则从淀粉的非还原端每次切下一个葡萄 糖。淀粉酶产生的这些还原糖能使3，5－二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3－氨基－5－硝基水杨 酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。可以用麦芽糖制作标准曲线，用比色法测定淀 粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。几乎所有植物 中都存在有淀粉酶，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，主要是α－和β－淀粉酶。α－淀 粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；而β－淀粉酶不耐热，在70℃15min则被钝化。根据它们的这 种特性，在测定时可先测定淀粉酶的总活力（α＋β），然后钝化其中之一，就可测出另一个的活 力。本实验采用加热钝化β－淀粉酶测定α－淀粉酶的活力，再与非钝化条件下总的酶活力比较，求 出β－淀粉酶的活力。 【器材与试剂】 1. 实验仪器 分光光度计，恒温水浴，离心机，具塞刻度试管，刻度吸管， 容量瓶。 2. 实验试剂 标准麦芽糖溶液（100 μg/mL）(精确称取100 mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容 至100 mL，取其中10 mL，用蒸馏水定容至100 mL)，3，5－二硝基水杨酸试剂（精确称取1 g 3， 5－二硝基水杨酸，溶于20 mL 2 mol/L NaOH溶液中，加入50 mL蒸馏水，再加入30 g酒石酸钾 钠，待溶解后用蒸馏水定容至100 mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用）， 0.1 mol/L pH 5.6的柠檬酸缓冲液（见附录表2），1％淀粉溶液(称取1 g淀粉溶于100 mL 0.1 mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中)， 0.4 mol/L NaOH溶液 。 3. 实验材料 萌发的小麦种子 【实验步骤】 1. 粗酶液制备：称取1.0 g萌发2-3天的小麦种子，置研钵中加1 mL蒸馏水和少量石英砂，研磨 成匀浆后转入离心管中，用5mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管，提取液在室温下放置浸提15～20 min，期间摇动使其充分提取。然后在3000 r/min转速下离心10 min，将上清液倒入50 mL容量瓶 中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取淀粉酶原液1 mL，放入50 mL容量瓶中， 用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶稀释液。 2. 绘制麦芽糖标准曲线：取7支干净的具塞刻度试管，编号1-7，将标准麦芽糖溶液（100 μg/mL）按照下表稀释成0-100 μg/mL的标准液（0、10、20、40、60、80、100 μg/mL）（表 5-4），每管依次加入3，5-二硝基水杨酸2 mL，摇匀，置沸水浴中煮沸5 min，取出后流水冷却， 以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定。以麦芽糖浓度为横座标，吸光度值为纵坐 标，绘制标准曲线或建立回归方程。 表5-4 标准麦芽糖溶液配制
试管编号 麦芽糖标准液(m)|00204081.21.6|2.0 蒸馏水(mL) 201.81.61.208|040 麦芽糖浓度(pg/mL)101020406080100 3.α-淀粉酶活力测定 (1)取6支干净的具塞刻度试管,编号1-6,1-3为对照,4-6为测定管; (2)每管中加入1mL淀粉酶原液,在70℃±0.5℃下准确加热15min,以钝化β-淀粉酶,立即冰 浴 (3)每个试管中加入0.1 mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液1mL (4)在1-3为对照管中分别加入4mL04mo/ NAoH溶液,以钝化酶活,再加入1%淀粉溶液2 mL,混匀; (5)将4-6测定管置于40℃恒温水浴中预热15min后,向其中加入40℃恒温水浴中预热的1%淀 粉溶液2mL,混匀并立即放回40℃恒温水浴中保温5min,迅速向试管中加入4mL0.4mol/l NaOH溶液,备下一步测糖含量 (6)取以上各管中的溶液2mL分别加入到10mL具塞试管中,另取一管加2mL柠檬酸缓冲液作 为比色测定时候的空白调零管,再分别加入3,5-二硝基水杨酸2mL,摇匀,置沸水浴中煮沸5 min,取出后流水冷却,在540nm波长下比色测定,记录数据于表5-5中,根据标准曲线求出麦芽糖 浓度,分别求出3个对照管与测定管中麦芽糖浓度的平均值,分别记作A'与A 4.∝-淀粉酶与β-淀粉酶总活力测定: (1)取6支干净的具塞刻度试管,编号7-12,7-9为对照,10-12为测定管 (2)每管中加入1mL淀粉酶稀释液; 以下按照α-淀粉酶活力测定中的步骤(3)-(6)进行,记录数据于表5-5中,分别求出3个对照管与 测定管中麦芽糖浓度的平均值,分别记作B′与B: 表5-5标准麦芽糖溶液配制 α-淀粉酶活力 (a+β)-淀粉酶总活力 对照 测定 对照 测定 试管编号12 OD540nm 麦芽糖浓度 (ug/mL) 平均麦芽糖浓 A 度(pg/mL)
试管编号 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液（mL） 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水（mL） 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 麦芽糖浓度（μg/mL） 0 10 20 40 60 80 100 3. α-淀粉酶活力测定： (1) 取6支干净的具塞刻度试管，编号1-6，1-3为对照，4-6为测定管; (2) 每管中加入1 mL 淀粉酶原液，在70℃±0.5℃下准确加热15 min，以钝化β-淀粉酶，立即冰 浴； (3) 每个试管中加入0.1 mol/L pH 5.6的柠檬酸缓冲液 1 mL； (4) 在1-3为对照管中分别加入4 mL 0.4 mol/LNaOH溶液， 以钝化酶活，再加入1%淀粉溶液2 mL， 混匀； (5) 将4-6测定管置于40℃恒温水浴中预热15 min后，向其中加入40℃恒温水浴中预热的1%淀 粉溶液2 mL，混匀并立即放回40℃恒温水浴中保温5 min，迅速向试管中加入4 mL 0.4 mol/L NaOH溶液，备下一步测糖含量。 (6) 取以上各管中的溶液2 mL分别加入到10 mL具塞试管中，另取一管加2 mL柠檬酸缓冲液作 为比色测定时候的空白调零管，再分别加入3，5-二硝基水杨酸2 mL，摇匀，置沸水浴中煮沸5 min，取出后流水冷却，在540nm波长下比色测定，记录数据于表5-5中，根据标准曲线求出麦芽糖 浓度，分别求出3个对照管与测定管中麦芽糖浓度的平均值，分别记作A’与A； 4. α-淀粉酶与β-淀粉酶总活力测定： (1) 取6支干净的具塞刻度试管，编号7-12，7-9为对照，10-12为测定管; (2) 每管中加入1 mL淀粉酶稀释液; 以下按照α-淀粉酶活力测定中的步骤(3)-(6)进行，记录数据于表5-5中，分别求出3个对照管与 测定管中麦芽糖浓度的平均值，分别记作B’与B； 表5-5 标准麦芽糖溶液配制 α-淀粉酶活力 (α+β) -淀粉酶总活力 对照 测定 对照 测定 试管编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 OD540nm 麦芽糖浓度 （μg/mL） 平均麦芽糖浓 度（μg/mL） A’ A B’ B
5.计算淀粉酶活性,淀粉酶活性以每克鲜重每分钟生成的麦芽糖微克数(μg/ g FW/min)表示。 α-淀粉酶活性=(A-A)×样品总体积÷(样品重×5) (a+β)-淀粉酶总活性=(B-B′)×样品总体积÷(样品重×5) β-淀粉酶活性=(α+β)-淀粉酶活性-α-淀粉酶活性 其中,A:α-淀粉酶测定管中(管4-6)麦芽糖浓度 A′:α-淀粉酶对照管中(管1-3)麦芽糖浓度; B:淀粉酶总活性测定管中(管10-12)麦芽糖浓度; B′:淀粉酶总活性对照管中(管7-9)麦芽糖浓度
5. 计算淀粉酶活性，淀粉酶活性以每克鲜重每分钟生成的麦芽糖微克数(μg/g FW/min)表示。 α-淀粉酶活性 = (A-A’) ×样品总体积÷(样品重×5) (α+β) -淀粉酶总活性 = (B-B’) ×样品总体积÷(样品重×5) β-淀粉酶活性 = (α+β) -淀粉酶活性-α-淀粉酶活性 其中， A： α-淀粉酶测定管中(管4-6)麦芽糖浓度; A’： α-淀粉酶对照管中(管1-3)麦芽糖浓度; B： 淀粉酶总活性测定管中(管10-12)麦芽糖浓度; B’： 淀粉酶总活性对照管中(管7-9)麦芽糖浓度