膜蛋白的晶体学研究
膜蛋白的晶体学研究
生物大分子结构研究的方法概况 (1)X一光晶体衍射(X-ray):这是目前生物 大分子结构解析最有效的一种方法,它有赖于 高度有序的三维晶体的获得 (2)核磁共振(NMR):这种方法已成功地用于 菌视紫质及有机溶剂中细菌FF。一ATP酶的F膜 功能区的C单元的结构解析 (3)电镜(EM)二维晶体及三维重构:目前 电子晶体学阐述的结构达到3埃的分辨率
生物大分子结构研究的方法概况 (1)X－光晶体衍射（X－ray）：这是目前生物 大分子结构解析最有效的一种方法，它有赖于 高度有序的三维晶体的获得。 (2)核磁共振（NMR）：这种方法已成功地用于 菌视紫质及有机溶剂中细菌F1F0－ATP酶的F0膜 功能区的C单元的结构解析。 (3)电镜（EM）二维晶体及三维重构： 目前， 电子晶体学阐述的结构达到3埃的分辨率
已测定的膜蛋白晶体结构(原子分辨水平) 膜蛋自 分辨率/m报道时间 光合色素反应中心 0.3 1985 大肠杆菌膜孔蛋白OmpF 0.24 大肠杆菌膜孔蛋白PhoE 1992 光合细菌膜孔蛋白 0.18 1992 麦芽糖孔蛋白 0.31 1995 光合细菌捕光蛋白复合体 0.25 1995 脱氮副球菌细胞色素c氧化酶 0.28 1995 牛心细胞色素c氧化酶 0.28 1996 牛心线粒体细胞色素bc1复合体 0.29 1997 菌紫红质 0.25 1997 钾通道 0.32 1998
膜蛋白 分辨率/nm 报道时间 光合色素反应中心 0.3 1985 大肠杆菌膜孔蛋白 OmpF 0.24 1992 大肠杆菌膜孔蛋白 PhoE 0.3 1992 光合细菌膜孔蛋白 0.18 1992 麦芽糖孔蛋白 0.31 1995 光合细菌捕光蛋白复合体 0.25 1995 脱氮副球菌细胞色素 c 氧化酶 0.28 1995 牛心细胞色素 c 氧化酶 0.28 1996 牛心线粒体细胞色素 bc1复合体 0.29 1997 菌紫红质 0.25 1997 钾通道 0.32 1998 已测定的膜蛋白晶体结构(原子分辨水平)
蛋白质晶体的类型 由于分子之间相互作用的性质不同,蛋白分 子可以形成三种不同类型的晶体,即三维晶休、 二维晶体和二维晶垛( stacks of2 D crystals) 其中,维系分子之间形成三维晶体的相互作用主 要来自亲水相互作用;而在二维晶体中,膜包埋 区域疏水相互作用是维系晶体结构的主要作用; 对二维晶垛,膜包埋区域仍是疏水作用,而层间 则是亲水作用
蛋白质晶体的类型 由于分子之间相互作用的性质不同，蛋白分 子可以形成三种不同类型的晶体，即三维晶休、 二维晶体和二维晶垛(stacks of 2D crystals)。 其中，维系分子之间形成三维晶体的相互作用主 要来自亲水相互作用；而在二维晶体中，膜包埋 区域疏水相互作用是维系晶体结构的主要作用； 对二维晶垛，膜包埋区域仍是疏水作用，而层间 则是亲水作用
膜蛋白三维结晶
膜蛋白三维结晶
dsO 去污剂-蛋白微团 形成的三维晶体
去污剂-蛋白微团 形成的三维晶体
晶体生长现象 从溶液中结晶是一个很普遍的自然现象,对于小分子、无机 盐、水溶性蛋白和膜蛋白而言,结晶的原理都是相同的。 为了使体系发生结晶,必需通过改变一个或者更多的物理参 数如浓度、温度、离子强度等来达到溶液的过饱和状态。通常 而言,这个过程变化越缓和,结晶过程就越好控制,高度有序 的晶体就更易于得到。 结晶包括两个连续的过程:成核和晶体生长。成核过程是 个可逆的过程。当晶核长大到一定程度时,它将进一步不可逆 地长大,形成一个新相,进而形成稳定的晶体 从微观角度而言,每一个分子具有六个自由度,三个水平和 三个旋转自由度,它们通过有序的堆积使体系的熵减少。在蛋 白经过有序堆叠形成晶体的同时,相邻分子间形成新键,进而 降低体系的自由能,这是形成结晶的驱动力
晶体生长现象 从溶液中结晶是一个很普遍的自然现象，对于小分子、无机 盐、水溶性蛋白和膜蛋白而言，结晶的原理都是相同的。 为了使体系发生结晶，必需通过改变一个或者更多的物理参 数如浓度、温度、离子强度等来达到溶液的过饱和状态。通常 而言，这个过程变化越缓和，结晶过程就越好控制，高度有序 的晶体就更易于得到。 结晶包括两个连续的过程：成核和晶体生长。成核过程是一 个可逆的过程。当晶核长大到一定程度时，它将进一步不可逆 地长大，形成一个新相，进而形成稳定的晶体。 从微观角度而言，每一个分子具有六个自由度，三个水平和 三个旋转自由度，它们通过有序的堆积使体系的熵减少。在蛋 白经过有序堆叠形成晶体的同时，相邻分子间形成新键，进而 降低体系的自由能，这是形成结晶的驱动力
水溶性蛋白和膜蛋白在结晶性质上的差异: 水溶性蛋白和膜蛋白在结晶性质上的差异主要是由其溶解性存 在差异的结果。溶解性的差异往往由蛋白的表面性质、蛋白的取 向极性,或者它们两者共同造成的 水溶性蛋白暴露出极性表面,在水溶液中各相同性。整合膜蛋 白是双亲性的,一般是垂直插过脂双层膜,它具有锚在膜上的疏 水核心,以及指向胞质侧和胞外侧的两个极性表面。 尽管膜蛋白难于形成三维结晶,经过艰苦的摸索也有成功的例 子。首先报道的菌视紫质和红细胞膜孔蛋白的三维结晶是从水溶 性去污剂溶液中得到的。最近,在膜蛋白的三维结晶中又引入了 两个新的概念,同时这两种新途径都获得了高分辨率的晶体结构。 其中之一是细菌色素C氧化酶与其构象专属性单克隆抗体的Fv片 段采用共晶方法得到的;另外一个是通过脂立方相技术得到的
水溶性蛋白和膜蛋白在结晶性质上的差异： 水溶性蛋白和膜蛋白在结晶性质上的差异主要是由其溶解性存 在差异的结果。溶解性的差异往往由蛋白的表面性质、蛋白的取 向极性，或者它们两者共同造成的。 水溶性蛋白暴露出极性表面，在水溶液中各相同性。整合膜蛋 白是双亲性的，一般是垂直插过脂双层膜，它具有锚在膜上的疏 水核心，以及指向胞质侧和胞外侧的两个极性表面。 尽管膜蛋白难于形成三维结晶，经过艰苦的摸索也有成功的例 子。首先报道的菌视紫质和红细胞膜孔蛋白的三维结晶是从水溶 性去污剂溶液中得到的。最近，在膜蛋白的三维结晶中又引入了 两个新的概念，同时这两种新途径都获得了高分辨率的晶体结构。 其中之一是细菌色素C氧化酶与其构象专属性单克隆抗体的Fv片 段采用共晶方法得到的；另外一个是通过脂立方相技术得到的
膜蛋白三维结晶需要分子伴侣: ).去污剂: De grip在研究质子受体视紫质和视蛋白在不同去污剂溶液中 的稳定性时发现以下经验性规则: (1)在分子大小相当时,非离子去污剂比兼性离子去污剂要温和 (2)在同系物中,烷基链较长的去污剂较温和。 (3)在同样烷基链的情况中,头部体积越大的去污剂越温和。 在 Rhodopseudomonas viridis的反应中心的晶格中发现,极 性的相互作用发生在蛋白之间、蛋白与胶束之间以及胶束之间。 去污剂的种类和大小对于这些相互作用来说是很关键的,对于一 定的膜蛋白其选择范围很狭窄。 膜蛋白三维结晶中往往采用一些烷基链较短,头部较小的去 污剂,这样能形成较小的胶束以使得膜蛋白本身具有最大的极性 接触面积来形成结晶
膜蛋白三维结晶需要分子伴侣： 1)．去污剂： De Grip在研究质子受体视紫质和视蛋白在不同去污剂溶液中 的稳定性时发现以下经验性规则： (1) 在分子大小相当时，非离子去污剂比兼性离子去污剂要温和。 (2) 在同系物中，烷基链较长的去污剂较温和。 (3) 在同样烷基链的情况中，头部体积越大的去污剂越温和。 在Rhodopseudomonas viridis 的反应中心的晶格中发现，极 性的相互作用发生在蛋白之间、蛋白与胶束之间以及胶束之间。 去污剂的种类和大小对于这些相互作用来说是很关键的，对于一 定的膜蛋白其选择范围很狭窄。 膜蛋白三维结晶中往往采用一些烷基链较短，头部较小的去 污剂，这样能形成较小的胶束以使得膜蛋白本身具有最大的极性 接触面积来形成结晶
膜蛋白三维结晶需要分子伴侣: 2).添加剂 在很多情况下,中性或带电的双亲小分子能改善膜蛋白 的三维结晶或是其结晶所必需。 在光合作用反应中心的结晶中,添加剂的加入使得与反 应中心相互作用的去污剂的数量减少。在膜孔蛋白的结晶中, 辛基寡聚还氧乙烯的加入可减慢结晶的速度。苯脎脒定的加 入使得菌视紫质在含0G的溶液的溶解增多。异丙醇的加入可 增大菌视紫质的晶体尺度。而且有些添加剂能自身结晶从而 为膜蛋白的结晶形成晶核表面。 Miche1提出双亲小分子的概念,去污剂/添加剂所形成 的胶束比纯去污剂所形成的胶束要小一些,这样更有利于胶 束在晶格中的堆积。 Garavito指出添加剂能提高胶束的变形 性,使得它们更适合于在晶格中的堆叠
膜蛋白三维结晶需要分子伴侣： 2).添加剂 在很多情况下，中性或带电的双亲小分子能改善膜蛋白 的三维结晶或是其结晶所必需。 在光合作用反应中心的结晶中，添加剂的加入使得与反 应中心相互作用的去污剂的数量减少。在膜孔蛋白的结晶中， 辛基寡聚还氧乙烯的加入可减慢结晶的速度。苯脎脒定的加 入使得菌视紫质在含OG的溶液的溶解增多。异丙醇的加入可 增大菌视紫质的晶体尺度。而且有些添加剂能自身结晶从而 为膜蛋白的结晶形成晶核表面。 Michel 提出双亲小分子的概念，去污剂/添加剂所形成 的胶束比纯去污剂所形成的胶束要小一些，这样更有利于胶 束在晶格中的堆积。Garavito 指出添加剂能提高胶束的变形 性，使得它们更适合于在晶格中的堆叠