第十五章基因工程
第十五章 基因工程
Host cell chromosome dNa to be cloned is cut with the same restriction enzyme Plasmid vector is removed from bacterial cell and cut with a restriction enzyme The two DNAs are ligated to form a recombinant molecule Introduction into host cell Selection for cells carrying recombinant plasmids by plating on medium with antibiotic or color indicator
所谓的遗传工程就是在分子水平上,用人工方法提取 (或合成)不同生物的遗传物质,在体外切割、拼接和重 新组合。然后通过载体把重组DNA分子引入受体细胞, 使外源DNA在受体细胞中进行复制和表达。按人们的需 要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状,并使之稳 定地遗传给下一代。所以基因工程( gene engineering)也 称为遗传工程( genetic engineering)、基因操作(gene manipulation)、DNA重组技术( recom bination dna techniques)。有时人们还称它为基因克隆( gene cloning 或分子克隆( molecular cloning)。 遗传工程的基本操作程序大致包括:目的基因的制备 载体的选择,体外DNA重组,重组DNA引入受体细胞 克隆转化子的筛选,重组DNA的检测等
所谓的遗传工程就是在分子水平上，用人工方法提取 （或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重 新组合。然后通过载体把重组ＤＮＡ分子引入受体细胞， 使外源ＤＮＡ在受体细胞中进行复制和表达。按人们的需 要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳 定地遗传给下一代。所以基因工程（gene engineering）也 称为遗传工程（genetic engineering）、基因操作（gene manipulation）、ＤＮＡ重组技术（recombination DNA techniques）。有时人们还称它为基因克隆（gene cloning） 或分子克隆（molecular cloning）。 遗传工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制备， 载体的选择，体外ＤＮＡ重组，重组ＤＮＡ引入受体细胞， 克隆转化子的筛选，重组ＤＮＡ的检测等
第一节基因工程的酶学基础 、限制性核酸内切酸( restriction endonuclease): 这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 ( restriction enzyme)。限制性内切酶本来是微生 物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶,其功 能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染,是细 胞中的一种防御机制。 根据酶的功能、大小和反应条件,及切割DNA 的特点,可以将限制性内切酶分为三类:
第一节 基因工程的酶学基础 一、限制性核酸内切酸（restriction endonuclease）： （ restriction enzyme）。限制性内切酶本来是微生 物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功 能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细 胞中的一种防御机制。 、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ 的特点，可以将限制性内切酶分为三类：
型酶:分子量较大,反应需Mg艹、S-腺苷酰--甲硫氨 酸(SAM)、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特 异的切割位点,所以在基因工程中应用不大。 Ⅱ型酶:分子量较小(10Da),反应只需Mg的存在, 并且具有以下两个特点,使这类酶在基因工程研究中,得 到广泛的应用。 识别位点是一个回文对称结构,并且切割位点也在这 回文对称结构上 许多工型酶切割DNA后,可在DNA上形成粘性末端 有利于DNA片段的重组。 Ⅲ型酶:这类酶可识别特定顺序,并在这一顺序的3′端 24-26bp处切开DNA,所以它的切割位点也是没有特异 性的
Ⅰ型酶：分子量较大，反应需Mg++ 、S-腺苷酰-L-甲硫氨 酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特 异的切割位点，所以在基因工程中应用不大。 Ⅱ型酶：分子量较小（105Da），反应只需Mg++的存在， 并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得 到广泛的应用。 •识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一 回文对称结构上。 •许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端， 有利于ＤＮＡ片段的重组。 Ⅲ型酶：这类酶可识别特定顺序，并在这一顺序的3’端 24~26bp处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异 性的
Recognition site 5′ G-A-A-T-T-C ⊥⊥ C·T-T-A-A-G Treatment with EcoRl 5TITG A-A·T-T-C Complementary tails C·TT-A-A G
Enzyme Recognition, Source cleavage sequence ECORITTTGAATT-CTT A-A-T-T. col T-T-A C HindTTTA-AG-CT-TTTT 千TTA A-G-C-T-T Hemophilus influenza r-T-C-G-A-A T-C-G-A BmH千TTg--A-T-c-c+T Tcl A-T-C-CTTT Bacillus amyloliquefaciens Lc-c.-A-GC⊥⊥⊥ C-T-A-G TaqlTT T-C-G-ATT Thermus aquaticus A-G-C-T-LL ⊥⊥A-G TTT A-G-C-T A-G Arthrobacter luteus Haelll TG--c-C千 Hemophilus aegypticus G Ball 千T-G-G-c-c-A+T C-C-ATTT Brevibacterium albidum ⊥⊥A.c.C Sau3A G-A-T-C A-T-C Staphylococcus aureus ⊥⊥c-T-A-G
同裂酶( isoschizomers): 指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶 同裂酶进行同样的切割,产生同样的末端。但有些 同裂、酶对甲基化位点的敏感性不同。 同尾酶( Isocaudamer) 指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘 性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的 选择余地更大
同裂酶（isoschizomers)： 指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。 同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些 同裂、酶对甲基化位点的敏感性不同。 同尾酶（isocaudamer）： 指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘 性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的 选择余地更大
限制性核酸内切酶的命名原则: 第一个字母:大写,表示所来自的微生物的属名的 第一个字母。 第二、三字母:小写,表示所来自的微生物种名的 第一、二个字母。 其它字母:大写或小写,表示所来自的微生物的菌 株号。 罗马数字:表示该菌株发现的限制酶的编号 例: ECOR I:来自于 Escheria coli ry13的第一个限 制酶
限制性核酸内切酶的命名原则： 第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的 第一个字母。 第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的 第一、二个字母。 其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌 株号。 罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。 例：EcoR I: 来自于Escheria coli RY13的第一个限 制酶
末端转移酶( terminal transferase) 该酶仝称为末端脱氧核苷酸转移酶( terminal deoxynucleotidyl transferase),它所催化的反应与 DNA polⅠ相似,所不同的是它不需要模板,它可 以含有3’-OH的DNA片段为引物,在3 OH端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在 平头DNA上合成一段寡聚核苷酸,从而形成粘性 末端
二、末端转移酶（terminal transferase） （terminal deoxynucleotidyl transferase），它所催化的反应与 DNA pol I 相似，所不同的是它不需要模板，它可 以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段为引物，在３’－ ＯＨ端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在 平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性 末端