微生物学实验指导黄文芳张松编著华南师范大学生命科学学院
1 微生物学实验指导 黄文芳 张 松 编著 华南师范大学生命科学学院
目录基础实验实验1培养基的配制·实验2消毒与灭菌·.5实验3微生物的接种技术.-13实验4微生物分离与纯化技术….....16实验5圆褐固氮菌的分离、纯化与测定.19实验6-22从病鱼体上分离、纯化病原菌实验7-24噬菌体分离、纯化与效价的测定.实验8各种微生物菌落形态的观察.30实验9细菌个体形态的观察.34实验10细菌细胞单染色观察…...36实验11细菌的革兰氏染色.·39实验12细菌鞭毛染色与观察..42实验13细菌芽孢染色与观察*45实验14细菌荚膜染色与观察·47实验15放线菌的形态观察·.49实验16酵母菌的形态观察..51实验 17霉菌的形态观察·54附在中学生物学教学中，如何观察微生物…·57实验18细菌和酵母菌体大小的测量.·59实验19微生物数量的测定..63实验20细菌生理生化反应试验·.·...73实验21多项微量生化反应快速鉴定技术86实验22氧影响微生物生长的试验·.·90实验23厌氧微生物的培养952
2 目 录 基础实验 实验 1 培养基的配制.1 实验 2 消毒与灭菌.5 实验 3 微生物的接种技术.13 实验 4 微生物分离与纯化技术.16 实验 5 圆褐固氮菌的分离、纯化与测定.19 实验 6 从病鱼体上分离、纯化病原菌.22 实验 7 噬菌体分离、纯化与效价的测定.24 实验 8 各种微生物菌落形态的观察.30 实验 9 细菌个体形态的观察.34 实验 10 细菌细胞单染色观察.36 实验 11 细菌的革兰氏染色.39 实验 12 细菌鞭毛染色与观察.42 实验 13 细菌芽孢染色与观察.45 实验 14 细菌荚膜染色与观察.47 实验 15 放线菌的形态观察.49 实验 16 酵母菌的形态观察.51 实验 17 霉菌的形态观察.54 附：在中学生物学教学中，如何观察微生物.57 实验 18 细菌和酵母菌体大小的测量.59 实验 19 微生物数量的测定.63 实验 20 细菌生理生化反应试验.73 实验 21 多项微量生化反应快速鉴定技术.86 实验 22 氧影响微生物生长的试验.90 实验 23 厌氧微生物的培养.95
实验24温度影响微生物生长的试验·100实验25不同NaC1浓度影响微生物生长的试验.·102实验26pH影响微生物生长的试验104实验27不同碳源物质对微生物培养生长的影响，106实验28108微生物菌种保藏·实验29免疫血清的制备·.110实验30凝集反应··113实验31沉淀反应··116综合实验实验32·119水中细菌学检查·1...119水中细菌总数的测定.II水中大肠菌群的检测·123实验33酒精发酵及糯米甜酒的酿制·128实验34高淀粉酶活性枯草芽孢杆菌菌株的筛选与育种技术.130实验35食用菌培养1353
3 实验 24 温度影响微生物生长的试验.100 实验 25 不同 NaCl 浓度影响微生物生长的试验.102 实验 26 pH 影响微生物生长的试验.104 实验 27 不同碳源物质对微生物培养生长的影响.106 实验 28 微生物菌种保藏.108 实验 29 免疫血清的制备.110 实验 30 凝集反应.113 实验 31 沉淀反应.116 综合实验 实验 32 水中细菌学检查.119 I 水中细菌总数的测定.119 I I 水中大肠菌群的检测 . . . . . . . . . . .123 实验 33 酒精发酵及糯米甜酒的酿制.128 实验 34 高淀粉酶活性枯草芽孢杆菌菌株的筛选与育种技术.130 实验 35 食用菌培养. 135
基础实验实验1培养基的配制一、目的学习和掌握培养基配制的一般方法和步骤。二、原理由人工配制供给微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的营养基质，称之为培养基。培养基中含有氮素、碳素、矿质元素、生长因子、水等物质，可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。三、材料、试剂与器具1、材料牛肉膏，蛋白陈，琼脂，可溶性淀粉，葡萄糖，孟加拉红，链霉素。2、试剂1mol/LNaOH，1mol/LHCI，KNO3，NaCl，K2HPO47H2OFeSO4-7H2O,CaSO4-2H2O,CaCO,等3、器具试管，三角瓶，瓷量杯，量筒，玻璃棒，天平，牛角匙，pH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，线绳，纱布，漏斗，漏斗架，胶管，止水夹等。四、操作步骤（一）牛肉膏蛋白陈固体培养基的配制牛肉膏蛋白陈培养基是一种适合许多细菌生长的最普通的细菌基础培养基。其配方如下：牛肉膏5g，蛋白陈10g，NaC15g，琼脂15~20g，水1000mL，pH7.4~7.61、称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品入瓷杯中。牛肉膏可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏溶解后，立即取出纸片。2、加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。4
4 基础实验 实验 1 培养基的配制 一、目的 学习和掌握培养基配制的一般方法和步骤。 二、原理 由人工配制供给微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的营养基质，称之为培养基。 培养基中含有氮素、碳素、矿质元素、生长因子、水等物质，可分为固体培养基、液 体培养基和半固体培养基。 三、材料、试剂与器具 1、材料 牛肉膏,蛋白胨，琼脂，可溶性淀粉，葡萄糖，孟加拉红， 链霉素。 2、 试剂 1mol/L NaOH，1mol/L HCI，KNO3，NaCl，K2HPO4·7H2O， FeSO4·7H2O，CaSO4·2H2O,CaCO3 等 3、 器具 试管，三角瓶，瓷量杯，量筒，玻璃棒，天平，牛角匙，pH 试纸，棉花， 牛皮纸，记号笔，线绳，纱布，漏斗，漏斗架，胶管，止水夹等。 四、操作步骤 （一） 牛肉膏蛋白胨固体培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种适合许多细菌生长的最普通的细菌基础 培养基。 其配方如下： 牛肉膏 5g，蛋白胨 10g，NaC1 5g，琼脂 15~20g，水 1000mL，pH7.4~7.6 1、称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品入瓷杯中。牛肉膏可放在称量 纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏溶解后，立即取出纸片。 2、加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并 用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼 脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最 后补足所失的水分
3、调pH用pH试纸检测培养基的pH，若偏酸，可滴加1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/LHC1进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。4、过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察，但是供一般使用的培养基，这步可省略。5、分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后垂直待凝三角瓶装量为容积的一半为宜。6、加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。分装过程和装置如图1-1。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起拔接洋接茶6BA图1-1培养基分装装置A.漏斗分装装置：B.自动分装器1.铁架：2.漏斗：3.乳胶管：4.弹簧夹：5.玻管：6.流速调节：7.装量调节：8.开关到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落（图1-2）。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞（图1-3）。7、包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮5
5 3、调 pH 用 pH 试纸检测培养基的 pH，若偏酸，可滴加 1mol/L NaOH，边加边搅 拌，并随时用 pH 试纸检测，直至达到所需 pH 范围。若偏碱，则用 1mol/L HC1 进行调 节。pH 的调节通常放在加琼脂之前。 4、过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用 4 层纱布趁热过滤，以利培养 的观察，但是供一般使用的培养基，这步可省略。 5、分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗 以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。固体培养基约为试管高度的 1/5，灭菌后垂 直待凝;三角瓶装量为容积的一半为宜。 6、加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。分装过程 和装置如图 1-1。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起 到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约 3/5 塞入试管口或瓶口内，以防棉塞 脱落（图 1-2）。有些微生物需要更好的通气，则可用 8 层纱布制成通气塞。有时也可用 试管帽或塑料塞代替棉塞（图 1-3）。 7、包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水 沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以 5 支或 7 支在一起，再于棉塞外包一层牛皮 图 1-1 培养基分装装置 A．漏斗分装装置；B．自动分装器 1．铁架；2．漏斗；3．乳胶管；4．弹簧夹；5．玻管；6．流速调节；7．装量调节；8．开关
纸，用绳扎好。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。8、灭菌将上述培养基于121.3℃（0.11Mpa）湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。9、摆斜面灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2。若制平板培养基，则培养基装入三角瓶中灭菌后，无菌操作倒入灭菌过的平皿中，约1.5一2mm厚。10、无菌检查将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24一28h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。（二）高氏1号固体培养基的配制高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3lg，NaCI0.5g，1K2HPO4-3H200.5g，MgSO4-7H200.5g,FeSO47H200.01g，琼脂15~20g，水1000mL，pH7.4~7.6。图1-3试管与试管帽A.细菌学试管：B.螺帽：C.塑料帽D.金属帽：E.棉塞1、称量和溶解按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解，再加入其他万分依次溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在10mL中加入0.1g的FeSO4-7H2O，配成浓度为0.01g/mL的贮备液，再在1000mL培图1-4摆斜面
6 纸，用绳扎好。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。 8、灭菌 将上述培养基于 121.3℃（0.11Mpa）湿热灭菌 20min。如因特殊情况不能 及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。 9、摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜 度，使斜面的长度不超过试管总长的 1/2。 若制平板培养基，则培养基装入三角瓶中灭菌后，无菌操作倒入灭菌过的平皿中， 约 1.5—2mm 厚。 10、无菌检查 将灭菌的培养基放入 37℃温箱中培养 24—28h，无菌生长即可使用， 或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。 （二）高氏 1 号固体培养基的配制 高氏 1 号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下： 可溶性淀粉 20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g， K2HPO4·3H2O 0.5g ， MgSO4·7H2O 0.5g ， FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂 15~20g，水 1000mL， pH7.4~7.6。 1、称量和溶解 按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成 糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解，再加入其他 万分依次溶解。对微量成分 FeSO4·7H2O 可先配成高浓度的贮备液 后再加入，方法是先在 10mL 中加入 0.1g 的 FeSO4·7H2O ， 配 成 浓度为 0.01g/mL 的贮备液，再在 1000mL 培 图 1-4 摆斜面 图 1-3 试管与试管帽 A.细菌学试管；B.螺帽；C.塑料帽 图 1-2 棉塞 D.金属帽；E.棉塞 A.正确 B.不正确
养基中加入以上贮备液1mL即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白培养基配制。2、pH调节、分装、包扎及无菌检查同牛肉膏蛋白陈培养基配制。（三）马丁民固体培养基的配制马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：K2HPO47H201g，MgSO4.7H200.5g，蛋白陈5g，葡萄糖10g，琼脂15~20g，3.3mL1%孟加拉红水溶液，0.3mL1%链霉素水溶液，水1000mL，自然pH。1、称量和溶解先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积，在1000mL培养液中加入1%的孟加拉红水溶液3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉营蛋白陈培养基配制。2、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白陈培养基配制。3、链霉素的加入链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液（配好的链霉素溶液保存于-20℃），在1000mL培养基中加1%链霉素水溶液0.3mL，混匀。（四）阿须贝（Ashby)无氮琼脂培养基此培养基用于分离自生固氮菌，其配方如下：甘露醇（或葡萄糖15g或煎糖15g）10g，K2HPO4:7H2O0.2g,NaC10.2g,MgSO47H00.g,CaC035g.CaSO4-2H2O0.1g,水1000mL,琼脂18~20g，pH7.0。配制方法法如同牛肉膏蛋白陈培养基配制方法。五、注意事项1、称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖以免吸潮。调pH时要小心操作，避免回潮。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。2、若配制液体培养基，则不加琼脂；若配制半固体培养基，1000mL水中则加入5~8g琼脂。六、实验报告记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。7
7 养基中加入以上贮备液 1mL 即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。 如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 2、pH 调节、分装、包扎及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 （三）马丁氏固体培养基的配制 马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下： K2HPO4·7H2O1 g ，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨 5g，葡萄糖 10g，琼脂 15~20g，3.3mL1％ 孟加拉红水溶液，0.3mL1％链霉素水溶液，水 1000mL，自然 pH。 1、称量和溶解 先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。 待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积，在 1000mL 培养液中加入 1％的孟加拉红水 溶液 3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 2、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 3、链霉素的加入 链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至 45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成 1％的溶液（配好的链霉素溶液保存于-20℃）， 在 1000mL 培养基中加 1％链霉素水溶液 0.3mL，混匀。 （四）阿须贝(Ashby)无氮琼脂培养基 此培养基用于分离自生固氮菌，其配方如下： 甘露醇（或葡萄糖 15g 或蔗糖 15g）10g，K2HPO4·7H2O 0.2g, NaCl 0.2g, MgSO4·7H2O 0.g, CaCO3 5g, CaSO4·2H2O 0.1g, 水 1000mL,琼脂 18~20g ,pH 7.0。 配制方法法如同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法。 五、注意事项 1、称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖以免吸潮。调 pH 时要小 心操作，避免回潮。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。 2、若配制液体培养基，则不加琼脂；若配制半固体培养基，1000mL 水中则加入 5~8g 琼脂。 六、实验报告 记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点
七、思考题1、配制固体培养基有哪几个步骤？在操作过程中应注意那些什么问题？为什么？2、培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌？若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培养基如何进行无菌检查？3、试设计对饮料进行无菌检查的实验。8
8 七、思考题 1、配制固体培养基有哪几个步骤？在操作过程中应注意那些什么问题？为什么？ 2、培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌？若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌 的培养基如何进行无菌检查？ 3、试设计对饮料进行无菌检查的实验
实验2消毒与灭菌I干热灭菌一、目的了解干热灭菌的原理和应用范围：学习掌握干热灭菌的操作技术。二、原理只杀死病原微生物，称之为消毒：把所有微生物杀死，称之为灭菌：把物体上的微生物去除掉，称之为除菌。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160~170℃），时间要长（1~2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引燃烧。用于干热灭菌的设备主要是电烘箱或干燥箱。三、材料、试剂与器具器具培养血、试管、吸管、电烘箱等。四、操作步骤1、将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通：灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。2、接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升到100℃时，关闭排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温，此时如果还未达到所需的160~170℃温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需温度。3、当温度升达到160~170℃时，恒温调节器会自动控制调节温度，保持此温度2h。4、切断电源、自然降温。4、待电烘箱内温度降到70℃以下后，才能打开箱门（以免骤然降温导致玻璃器血炸裂）。取现灭菌物品。五、注意事项干热灭菌过程，严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。六、实验报告9
9 实验 2 消毒与灭菌 Ⅰ 干热灭菌 一 、目的 了解干热灭菌的原理和应用范围；学习掌握干热灭菌的操作技术。 二、原理 只杀死病原微生物，称之为消毒；把所有微生物杀死，称之为灭菌；把物体上的微 生物去除掉，称之为除菌。 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。与湿热 灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160~170℃），时间要长（1~2h），但干热灭菌温度不 能超过 180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引燃烧。用于干热灭菌的设备主 要是电烘箱或干燥箱。 三、材料、试剂与器具 器具 培养皿、试管、吸管、电烘箱等。 四、操作步骤 1、将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。 物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以 防包装纸烤焦起火。 2、接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐 渐上升。当温度升到 100℃时，关闭排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表 示箱内停止加温，此时如果还未达到所需的 160~170℃温度，则需转动调节器使红灯再亮， 如此反复调节，直至达到所需温度。 3、当温度升达到 160~170℃时，恒温调节器会自动控制调节温度，保持此温度 2h。 4、切断电源、自然降温。 4、 待电烘箱内温度降到 70℃以下后，才能打开箱门(以免骤然降温导致玻璃器皿炸 裂)。取现灭菌物品。 五、注意事项 干热灭菌过程，严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。 六、实验报告
检查无菌的效果。七、思考题1、在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？2、为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度要高，时间要长？Ⅱ高压蒸气灭菌一、目的1、了解高压蒸气灭菌的原理。2、学习掌握高压蒸气灭菌的操作方法。二、原理高压蒸气灭菌的是将待灭菌的物品放在一个密闭的压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气将锅内的冷空气从排气阀中驱尽后关闭排气阀，继续加热，此时锅内就充满纯水蒸气而又不能溢出，则增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。此时可有效地杀死包括热抗性孢子在内的各种微生物。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体含水分高，蛋白质较易凝固。因蛋白质含水量增加，凝固所需温度降低（表2-1)：二是湿热的穿透力比干热大（表2-2）：三是湿热的蒸气有潜热存在，1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.2kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。表2-1蛋白质含水量与凝固所需温度的关系卵白蛋白含水量/%30分钟内凝固所需温度/℃50562574~801880~9061450160~170在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内的冷空气是否排尽是极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压。所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气的水蒸气的温度低于饱和水蒸气的温度。灭菌锅内留有不同的分量空气时，压力与温度的关系见表（2-3）10
10 检查无菌的效果。 七、思考题 1、在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？ 2、为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度要高，时间要长？ Ⅱ 高压蒸气灭菌 一、目的 1、了解高压蒸气灭菌的原理。 2、学习掌握高压蒸气灭菌的操作方法。 二、原理 高压蒸气灭菌的是将待灭菌的物品放在一个密闭的压灭菌锅内，通过加热，使灭菌 锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气将锅内的冷空气从排气阀中驱尽后关闭排气阀， 继续加热，此时锅内就充满纯水蒸气而又不能溢出，则增加了灭菌锅内的压力，从而使沸 点高于 100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。此时可有效地杀死包 括热抗性孢子在内的各种微生物。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体含水 分高，蛋白质较易凝固。因蛋白质含水量增加，凝固所需温度降低(表 2-1)；二是湿热的 穿透力比干热大（表 2-2）；三是湿热的蒸气有潜热存在，1g 水在 100℃时，由气态变为 液态时可放出 2.2kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增 加灭菌效力。 表 2-1 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系 卵白蛋白含水量/% 30 分钟内凝固所需温度/℃ 50 56 25 74~80 18 80~90 6 145 0 160~170 在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内的冷空气是否排尽是极为重要，因为空气 的膨胀压大于水蒸气的膨胀压。所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气的 水蒸气的温度低于饱和水蒸气的温度。灭菌锅内留有不同的分量空气时，压力与温度的 关系见表（2-3）