实验十二、线粒体的分级分离及电子传递的检测一、实验目的：1、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法：2、对分离得到的线粒体进行电子传递的检测
一、实验目的： 1、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法； 2、对分离得到的线粒体进行电子传递的检测 实验十二、线粒体的分级分离及电子传 递的检测
二、实验原理细胞器分离基本步骤分离、纯化细胞器鉴定细胞破碎（一）细胞破碎的方法1.杆状玻璃匀浆器法2.高速组织捣碎机法3.超声波处理法4.化学裂解法5.反复冻融法
细胞器分离基本步骤 二、实验原理 细胞破碎 分离、纯化 细胞器鉴定 （一）细胞破碎的方法 1.杆状玻璃匀浆器法 2.高速组织捣碎机法 3.超声波处理法 4.化学裂解法 5.反复冻融法
细胞破碎的注意事项：1、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液（0.25mol/L）。它比较接近细胞质的分散相，具有足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小在pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。2、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。3、若是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长，导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解
细胞破碎的注意事项： 1、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液 （0.25mol/L ）。它比较接近细胞质的分散相，具有 足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小， 在pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。 2、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。 3、若是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中 的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束 不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长， 导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解
（二）分离纯化的方法根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术。离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法主要包括差速离心、密度梯度离心等方法
（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心 成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术。 离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮 力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。 主要包括差速离心、密度梯度离心等方法
差速离心法（Differentialcentrifugation根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别，分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方法。从低速到高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降系数相差较大（10倍及以上）的颗粒
根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别， 分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方 法。从低速到高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降 系数相差较大（10倍及以上）的颗粒。 差速离心法 (Differential centrifugation)
9.4IsolationandCharacterizationofCellOrganelles（细胞器）Centrifugationcanseparatemanytypesofoganellesfrom cellhomogenate,1st Step:Differential centrifugationFilterhomogenatetoremoveclumpsofunbrokencells,connectivetissue,etc.CentrifugeSupernatant(上清液)Pourout:rout:Poulout:300,000gx15000gx100.000gx10min60m2hPourout6tinPelletPlasmaLRibosomalLMitochondria,SolubleFilterNucleipartofmembrane,subunits,chloroplasts,homogenate(颗粒团)smallmicrosomalcytoplasmlysosomes,fractionpolyribo-and(cytosol)(fragmentsofsomesperoxisomesendoplasmicreticulum),and largepolyribosomes沉降顺序：细胞核一线粒体,溶酶体与过氧化物酶体一内质网与高尔基体一核糖体
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 1st Step: Differential centrifugation 沉降顺序：细胞核—线粒体,溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高尔基体—核糖体。 Pellet (颗粒团) Supernatant (上清液)
差速离心法（Differentialcentrifugation优点：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；须经反复悬浮和离心加以纯化；②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活
优点：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀 分开，并可使用容量较大的角式转子。 缺点：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；须经反复 悬浮和离心加以纯化； ②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离 心管一侧会出现沉淀； ③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变 形、聚集而失活。 差速离心法 (Differential centrifugation)
9.4IsolationandCharacterizationofCellOrganelles（细胞器）Centrifugationcanseparatemanytypesof oganellesfrom cellhomogenate,2nd Step:Density-gradient centrifugationOrganellefraction1.09Lysosomes(1.12 g/cm3)s1.111.15Mitochondria(1.18 g/cm3)1.191.22Peroxisomes1.25(1.23 g/cm3)BeforeAftercentrifugationcentrifugation常用介质（高溶解性的情性物质）：氯化、蔗糖、多聚蔗糖
常用介质(高溶解性的惰性物质): 氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖 9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 2nd Step: Density-gradient centrifugation
密度梯度离心(Density-gradient centrifugation)，当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。·两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，线粒体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部
• 当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下， 颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形 成区带的方法。 • 两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，线粒体和 比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉 降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。 密度梯度离心 （Density-gradient centrifugation）
（三）线粒体电子传递的检测在线粒体结构完好的条件下，如果将NAD+加入到线粒体的悬浮液中，在没有氧气存在的条件下，电子传递不会发生NAD+也不被氧化，而当加入NAD+的同时注入氧气，伴随着电子传递，NAD+接受电子被氧化，同时会将H+外排至线粒体悬浮液中，通过检测悬浮液的酸化，即pH降低，即可证实电子传递的发生。pHelectrodeOzadded60O,solutionoeon40(jowOL20NoO,C1060120180240300MitochondrionElapsedtime (s)
（三）线粒体电子传递的检测 在线粒体结构完好的条件下，如果将NAD+加入到线粒体 的悬浮液中，在没有氧气存在的条件下，电子传递不会发生， NAD+也不被氧化，而当加入NAD+的同时注入氧气，伴随着电 子传递，NAD+接受电子被氧化，同时会将H +外排至线粒体悬 浮液中，通过检测悬浮液的酸化，即pH降低，即可证实电子 传递的发生