DNA分子的体外连接一：实验目的及背景·在一定条件下DNA连接酶催化两个双链DNA片段相的5端磷酸与3端羟基之间形成磷酸酸脂键.DNA分子的接是在酶切反应获得互补序列基础上进行的。常用的两种DNA连接酶：(1）大肠杆菌的DNA连接酶(2)噬菌体的T.DNA连接酶。·DNA连接酶的最适反应温度为37℃C，但在此温度下，粘性末未端的氢键结合很不稳定，折衷方法是12℃过夜
DNA分子的体外连接 一．实验目的及背景 • 在一定条件下,DNA连接酶催化两个双链DNA片段相 邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸酸脂键,DNA分 子的连接是在酶切反应获得互补序列基础上进行的。 常用的两种DNA连接酶： (1) 大肠杆菌的DNA连接酶, (2) 噬菌体的T4DNA连接酶。 • DNA连接酶的最适反应温度为37℃，但在此温度 下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是12℃ 过夜
·DNA的未端性质由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性未端，因而连接反应中就有平末端连接和粘性末端连接。粘性末端连接效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上有差异。·碱性磷酸酶处理质粒载体为提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，来增加重组子比例，可是这又会引起DNA自身连接的问题。为此，通常选择对载体进行碱性磷酸酶处理，除去其5'未端的磷酸基，防止自身环化。·连接反应的检测连接反应成功与否，要通过下一步实验，转化宿主菌，对阳性克隆的筛选来确定
• DNA的末端性质 由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因 而连接反应中就有平末端连接和粘性末端连接。 粘性末 端连接效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上有差异。 • 碱性磷酸酶处理质粒载体 为提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，来增加 重组子比例，可是这又会引起DNA自身连接的问题。为 此，通常选择对载体进行碱性磷酸酶处理，除去其5’末端 的磷酸基，防止自身环化。 • 连接反应的检测 连接反应成功与否，要通过下一步实验，转化宿主菌， 对阳性克隆的筛选来确定
二、实验试剂1.纯化后的酶切质粒载体和目的基因。2.10XTDNA连接酶buffer200mMTris-HCI(pH7.6)50mMMgCI250mM二硫糖醇500μl/mlBSA3.TDNA连接酶三、实验步骤胶回收载体（EcoRI/HindII）3 μl (~50ng)连接反应：胶回收插入片段（EcoRI/Hind）5.5μl（~50ng）T4 DNA Ligase0.5ul10xbuffer1 μl总体积(两人一组）10 μl盖上管盖，混匀，台式离心机上离心5秒。20℃连接1小时。反应结束后于-20℃保存
二、实验试剂 1. 纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 2. 10× T4 DNA连接酶buffer 200mM Tris-HCl(pH7.6) 50mM MgCl2 50mM 二硫苄糖醇 500μl/ml BSA 3. T4 DNA连接酶 三、实验步骤 胶回收载体（EcoR I /HindIII ） 3 µl（~50ng） 胶回收插入片段（EcoR I /HindIII ） 5.5 µl （~50ng） T4 DNA Ligase 0.5ul10X buffer 1 µl 总体积 10 µl （两人一组） 盖上管盖，混匀，台式离心机上离心5秒。20℃ 连接1小时。反应结束后于-20℃保存。 连接反应：
四、问题与讨论：1.简述T4DNA连接酶作用机理2.简述一个完整外源DNA的克隆过程3.连接反应中应注意些什么问题及如何提高连接效率
四、问题与讨论： 1. 简述T4 DNA连接酶作用机理。 2. 简述一个完整外源DNA的克隆过程。 3. 连接反应中应注意些什么问题及如何提高连接效率
感受态细胞的制备与DNA的转化一：实验目的及背景（一）什么是感受态细胞（Competent cell）？细胞处于能够吸收外源DNA的状态称感受态，经特殊处理后处于此状态的细胞称感受态细胞（1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）。（3）受体细胞为限制修饰酶缺陷型，使转入的DNA分子不易被切除或破坏
感受态细胞的制备与DNA的转化 （1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以 溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）。 （2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透 性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）。 （3）受体细胞为限制修饰酶缺陷型，使转入的DNA分 子不易被切除或破坏。 (一) 什么是感受态细胞（Competent cell ）？ 细胞处于能够吸收外源DNA的状态称感受态，经 特殊处理后处于此状态的细胞称感受态细胞。 一．实验目的及背景
（二）感受态细胞可以用来做什么？将构建好的载体转入感受态细胞进行表达（转化）不仅可以检验重组DNA是否构建成功，还可作为重组DNA的宿主进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。（三）常见感受态细胞的制备方法电击法：利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮液，使细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔溶液中的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部。CaCl2法：细菌处于0℃低渗的CaCl,溶液中，细胞膨胀成球形，待转化的DNA与Ca2+形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物吸附于细胞表面。42℃短时间热击处理，促使细胞吸收外源DNA
(二) 感受态细胞可以用来做什么？ 将构建好的载体转入感受态细胞进行表达(转化)， 不仅可以检验重组DNA是否构建成功，还可作为重组 DNA的宿主进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。 (三) 常见感受态细胞的制备方法 电击法: 利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮 液，使细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔， 溶液中的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部。 CaCl2 法: 细菌处于0℃低渗的CaCl2溶液中，细胞膨胀 成球形，待转化的DNA与Ca2+形成抗DNase的羟基-钙 磷酸复合物吸附于细胞表面。42℃短时间热击处理，促 使细胞吸收外源DNA
两种方法的区别：做电击转化时，悬液中会有大部分细胞会因电击而死亡，但是这种方法很直接，转化效率很高。但是需要专门的仪器。CaCl法操作简单，不需要特殊设备，转化效率足以满足一般克隆实验的需要，故使用范围非常广。（四）重组子筛选方法：1.抗生素筛选法：由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr），可通过Amp抗性来筛选转化子，如受体细胞没有转入质粒，则在含Amp的培养基上不能生长，能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)已导入了质粒。质粒在菌体内扩增后，可将其提取出来，进行电泳、酶切等进一步鉴定
两种方法的区别： 做电击转化时，悬液中会有大部分细胞会因电击而 死亡，但是这种方法很直接，转化效率很高。但是需 要专门的仪器。 CaCl2法操作简单，不需要特殊设备，转化效率足 以满足一般克隆实验的需要，故使用范围非常广。 1. 抗生素筛选法：由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因 (Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子，如受体细胞 没有转入质粒，则在含Amp的培养基上不能生长，能 在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)已导入了质粒。 质粒在菌体内扩增后，可将其提取出来，进行电泳、 酶切等进一步鉴定。 (四) 重组子筛选方法：
2.互补筛选法：载体含有β一半乳糖苷酸基因（lacz）的调控序列和头146个氢基酸编码区。这个编码区中插入一个多克隆位点。受体菌则含编码β一半乳糖苷酶C端氨基酸的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有β一半乳糖苷酶表达，在生色底物5-溴-4-氯-3-哚-β-D一半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lac基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。3.直接DNA电泳法：利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大的特性，直接从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量来确定
2. 互补筛选法：载体含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的 调控序列和头146个氨基酸编码区。这个编码区中插入一 个多克隆位点。受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端氨基 酸的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－ 半乳糖苷酶表达， 在生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D－半 乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。而当有外源基 因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因 不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同而区分重组子和非 重组子。 3. 直接DNA电泳法：利用有插入片段的重组载体的分子 量比野生型载体分子量大的特性，直接从转化后的菌体克 隆中分离质粒，电泳、比较其分子量来确定
4，酶切验证法：根据已知外源DNA序列的限制性酶切图谱选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片段，再用其它酶切这个片段，电泳后比较结果是否符合预期结果。5.菌落PCR验证法：通过煮沸细菌菌落而获得细菌内的DNA，再通过PCR检测是否能扩增出预期的DNA插入片段6.质粒DNA测序法：从细菌中提取质粒DNA,对其进行测序。7.Southern印迹法：从细菌中提取DNA（或质粒载体），再和与转化外源DNA序列互补的DNA或RNA探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，显示出杂交信号。本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理使其处于感受态，然后与质粒共保温，实现转化
4. 酶切验证法：根据已知外源DNA序列的限制性酶切图谱， 选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带 数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片段，再用其它酶 切这个片段，电泳后比较结果是否符合预期结果。 5. 菌落PCR验证法：通过煮沸细菌菌落而获得细菌内的DNA， 再通过PCR检测是否能扩增出预期的DNA插入片段。 6. 质粒DNA测序法：从细菌中提取质粒DNA,对其进行测序。 7. Southern印迹法：从细菌中提取DNA（或质粒载体），再 和与转化外源DNA序列互补的DNA或RNA探针杂交。只有带 有插入片断的重组载体才能与探针杂交,显示出杂交信号。 本实验以E. coli DH5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理， 使其处于感受态，然后与质粒共保温，实现转化
二、实验材料1.材料E.coliDH5α菌株，Amp；pBS质粒DNA（购买或实验室自制），1.5mL离心管。2.设备恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪。3.试剂(1)LB培养液(2)Amp储存液（50mg/mL），(3）含Amp的LB固体培养基(4)0.1M CaCl2溶液(5)无菌水
二、实验材料 1. 材料 E. coli DH5α菌株，Ampˉ；pBS质粒DNA（购 买或实验室自制），1.5mL离心管。 2. 设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心 机，无菌工作台，低温冰箱， 恒温水浴锅，制冰机， 分光光度计，微量移液枪。 3. 试剂 (1) LB培养液, (2) Amp储存液（50mg/mL）, (3) 含Amp的LB固体培养基, (4) 0.1M CaCl2溶液, (5) 无菌水