《植物生理学实验》植物SOD酶活性的测定
《植物生理学实验》 植物SOD酶活性的测定
实验目的(NBT)>学习掌握用氮蓝四唑法来测定植物超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活力>了解不同胁迫方式（盐、温度等）对植物叶片（如水稻幼苗）SOD酶的影响
一、实验目的 学习掌握用氮蓝四唑（NBT）法来测定植物 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD） 的活力。 了解不同胁迫方式（盐、温度等）对植物叶片 （如水稻幼苗）SOD酶的影响
实验原理二、SOD发现1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到SOD，1969年McCord等重新发现其生物活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD分布：广泛分布在各种生物体内，其活性高低可作为抗衰老的指标SOD类型SOD是含Cu、Zn、Mn、Fe金属元素、能清除超氧阴离子自由基的酶其类型有Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD
二、实验原理 SOD发现： 1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到SOD，1969年 McCord等重新发现其生物活性，是生物体内清除自由基的 首要物质。 SOD分布： 广泛分布在各种生物体内，其活性高低可作为抗衰老的指标。 SOD类型： SOD是含Cu、Zn、Mn、Fe金属元素、能清除超氧阴离子 自由基的酶，其类型有Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD
PHSP450G6PDHLPO6-PhosphogluconateFreeRadicaXenobioticsIntermediateNAD+NADPHPHSGSHReductaseP450GSSGSODQuinoneNADPHCSHPeroxidaseP450Reductase+2/+3SemiquinoneSOD:具有一定的保护作用能有效抑制膜脂过氧化，Bd直OxidativeDamageDNAProteinsLipids
SOD：能有效抑制膜脂过氧化，具有一定的保护作用
盐胁迫对植物叶片SOD酶的影响在一定盐浓度范围的胁迫下，植物叶片中SOD活性随盐浓度的升高而增强盐胁迫的损伤在一定范围内可以修复（过氧化氢酶）、POD（过氧化膜系统修复与SOD、CAT物酶）等抗氧化酶的活性和ASA（抗坏血酸）、GSH（谷胱甘肽）等抗氧化物含量的变化密切相关
在一定盐浓度范围的胁迫下，植物叶片中SOD活性随盐浓度 的升高而增强。 盐胁迫的损伤在一定范围内可以修复。 膜系统修复与SOD、CAT（过氧化氢酶）、POD（过氧化 物酶）等抗氧化酶的活性和ASA (抗坏血酸)、GSH (谷胱甘 肽) 等抗氧化物含量的变化密切相关。 盐胁迫对植物叶片SOD酶的影响
SOD测定方法直接法：脉冲辐射分解法、电子顺磁共振波法、核磁共振法羟胺间接法（化学法）：邻苯三酚自氧化法、细胞色素C还原法、法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、肾上腺素法等。免疫法：放射免疫法、化学发光免疫分析法、ELISA法等。因为超氧阴离子自由基寿命短，不稳定，不易直接测定SOD活性，[因而采用间接法测定常用有3种：(NBT法）氮蓝四唑光化还原法邻苯三酚自氧化法化学发光法
SOD测定方法 直接法：脉冲辐射分解法、电子顺磁共振波法、核磁共振法。 间接法（化学法）：邻苯三酚自氧化法、细胞色素C还原法、羟胺 法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、肾上腺素法等。 免疫法：放射免疫法、化学发光免疫分析法、ELISA法等。 因为超氧阴离子自由基寿命短，不稳定，不易直接测定SOD活 性，因而采用间接法测定。 常用有3种：氮蓝四唑光化还原法 （NBT法） 邻苯三酚自氧化法 化学发光法
NBT法测定SOD酶活性的原理在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，还原的核黄素极易再氧化产生氧自由基，氧自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腺，甲在560nm处有最大吸收值。SOD可清除氧自由基，从而抑制甲形成光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低；反之，酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小酶单位/样品量：
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，还原的核黄 素极易再氧化产生氧自由基，氧自由基可将氮蓝四唑还 原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm处有最大吸收值。SOD 可清除氧自由基，从而抑制甲腙形成。 光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低；反 之，酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 酶单位/样品量 = NBT法测定SOD酶活性的原理
核黄素：在有氧物质存在下，还原的核黄素与氧反应产生氧自由基氮蓝四唑NBT）：氧自由基将无色（或微黄）的NBT还原为蓝色甲腺。提供核黄素的还原反应所需的电子供体，使甲硫氨酸：得核黄素的光激发还原反应得以进行SOD酶：SOD通过催化氧自由基歧化反应，生成O,与HO2，从而抑制蓝色甲形成。SOD催化反应如下：SODX+2H0; +0,>H202+0
核黄素：在有氧物质存在下，还原的核黄素与氧反应产 生氧自由基。 氮蓝四唑(NBT)：氧自由基将无色(或微黄)的NBT还原为 蓝色甲腙。 甲硫氨酸：提供核黄素的还原反应所需的电子供体，使 得核黄素的光激发还原反应得以进行。 SOD酶：SOD通过催化氧自由基歧化反应，生成O2与 H2O2，从而抑制蓝色甲腙形成。SOD催化反应如下： O2 O2 2H H2 O2 O2 SOD
实验材料、仪器与试剂二、材料：植物胁迫处理后的叶片等。仪器设备：电子天平，高速台式离心机，分光光度计，移液器，荧光灯（反应试管处照度为4000Lx），试管，研钵，烧杯，离心管，量筒等。试剂：(pH7.8)SOD抽提液：50mmol/L石磷酸缓冲液甲硫氨酸(Met)溶液：14.5mmol/L，现配现用（NBT）：2.25mmol/L，避光保存，氮蓝四唑溶液现配现用核黄素溶液：60umol/L，避光保存，现配现用EDTA-Na,溶液：3umol/L
二、实验材料、仪器与试剂 材料：植物胁迫处理后的叶片等。 仪器设备：电子天平，高速台式离心机，分光光度计，移液器， 荧光灯（反应试管处照度为4000Lx），试管，研钵，烧杯，离心 管，量筒等。 试剂： SOD抽提液：50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8） 甲硫氨酸（Met）溶液： 14.5mmol/L，现配现用。 氮蓝四唑溶液（NBT）：2.25mmol/L，避光保存，现配现用。 核黄素溶液： 60μmol/L，避光保存，现配现用。 EDTA－Na2溶液：3μmol/L
(供参考）主要试剂配制（1）50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.8):A液：NaH,PO4：2H,O（分子量156.01）：3.12g溶于蒸馏水定溶至100mLcB液：Na,HPO4·12H,O（分子量358.14）：7.17g溶于蒸馏水定溶至100mL。取A液8.5mL与B液91.5mL混合，定容至400mL，pH7.8。（2）SOD提取液：50mmol/L磷酸缓冲液【含0.1mmol/LEDTA；0.3%(w/v）TritonX-100；2-4%（w/v）聚乙烯聚吡咯烷酮(PVP）pH7.8]即每升磷酸缓冲液中加20gPVP，200μL0.5mol/L的EDTA母液3mlTritonX-100
主要试剂配制（供参考）： （1）50mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.8）： A液：NaH2PO4 · 2H2O（分子量156.01）： 3.12g溶于蒸馏水， 定溶至100mL。 B液：Na2HPO4 · 12H2O（分子量358.14）： 7.17g溶于蒸馏水， 定溶至100mL。 取A液8.5mL与B 液91.5mL混合，定容至400mL，pH7.8。 （2）SOD提取液：50mmol/L磷酸缓冲液 [含0.1mmol/L EDTA； 0.3%(w/v) Triton X-100；2-4%（w/v）聚乙烯聚吡咯烷酮 （PVP ）, pH7.8]。 即每升磷酸缓冲液中加20g PVP，200μL 0.5mol/L的EDTA母液， 3ml Triton X-100