基因克隆的技术路线ForeignDNA载体目的基因regionof interestgeneforPlasmidEcoRIantibiotic?EcORIresistanceEcoRI体外连接EcoRIEcoRI重组子（（杂合DNA）Stickyends转化Hybridization+DNAligaseRecombinant受体细胞DNADNAinsertionBacteria筛选阳性克隆BacteriaplattedonmediumBacterialcellchromosome+antabioticCloningOnlybacteriacontaining大量扩增，家获得子代DNArecombinantDNAgrowSCulture!CloneDNA户purification目的基因在原核细胞中表达Cloning into a plasmid
目的基因 载体 体外连接 重组子（杂合DNA） 转化 受体细胞 筛选阳性克隆 大量扩增，获得子代DNA 基因克隆的技术路线 目的基因在原核细胞中表达
质粒DNA提取常见问题口问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？请涂布平板培养后，重新挑原因选新菌落进行液体培养可减少菌体用量或增加溶液2.菌体老化的用量1碱裂解不充分2.不要频繁转接，每次接种时3.对策应接种单菌落。检查抗生素菌体中无质粒3.使用浓度是否正确。溶液使用不当4.溶液Ⅱ在温度较低时可能出现浑，置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液
1. 菌体老化 2. 碱裂解不充分 3. 菌体中无质粒 4. 溶液使用不当 1. 请涂布平板培养后，重新挑 选新菌落进行液体培养 2. 可减少菌体用量或增加溶液 的用量 3. 不要频繁转接，每次接种时 应接种单菌落。检查抗生素 使用浓度是否正确。 4. 溶液Ⅱ在温度较低时可能出 现浑浊，置于37℃保温片刻 直至溶解为清亮的溶液。 原因 对 策 质粒DNA提取常见问题 问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？
口问题二：质粒纯度不高，如何解决？原因1.不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质混有蛋白2.加入RNaseA室温放置一段时间对策混有RNA2.3.加入溶液I1和II后防止剧烈振混有基因组DNA3荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时
1.不要使用过多菌体。重新纯化 DNA，去除蛋白、多糖、多酚等 杂质 2.加入RNaseA室温放置一段时间 3.加入溶液II 和III后防止剧烈振 荡，可能把基因组DNA剪切成碎 片从而混杂在质粒中。细菌培养 时间过长会导致细胞和DNA的降 解，培养时间不要超过16小时。 问题二：质粒纯度不高，如何解决？ 原因 对 策 1. 混有蛋白 2. 混有RNA 3. 混有基因组DNA
DNA的酶切DNA片段从琼脂糖凝胶中的分离
DNA的酶切 DNA片段从琼脂糖凝胶中的分离
·限制性核酸内切酶：原核生物中存在的一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。以内切的方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端带磷酸基团，3’端为-0H
• 限制性核酸内切酶: 原核生物中存在的一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的 核酸水解酶。 以内切的方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片 段5’端带磷酸基团，3’端为-OH
限制性核酸内切酶分类·识别切割特性催化条件是否具有修饰酶活性至2005年1月，共发现限制酶3681种一1型59种（识别特异，切割不特异）-ⅡI型3612种（识别特异，切割特异）一型10种（识别特异，切割不特异）·商业化的限制酶有588种
限制性核酸内切酶分类 • 识别切割特性 • 催化条件 • 是否具有修饰酶活性 • 至2005年1月，共发现限制酶3681种 –Ⅰ 型59种 (识别特异，切割不特异） –Ⅱ 型3612种 (识别特异，切割特异） –Ⅲ 型10种 (识别特异，切割不特异） • 商业化的限制酶有 588 种
Ⅱ型限制性内切酶·占90%以上，即通常指的DNA限制性内切酶，它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割产生特异的DNA片段：·分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为4-6个碱基对的反转重复顺序：切割双链DNA产生3种不同的切口：5端突出，3端突出和平末端
Ⅱ型限制性内切酶 • 占90%以上，即通常指的DNA限制性内切酶，它们能 识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割， 产生特异的DNA片段； • 分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识 别顺序一般为4-6个碱基对的反转重复顺序； • 切割双链DNA产生3种不同的切口：5’端突出，3’端突 出和平末端
EcoRI
EcoRI
5CUTEco RI限制性内切酶3SG识别特定的5G城基序列CUTHind IlI3TT-CUT
酶切反应注意事项1.识别位点：注意选择适合的识别位点和形成的末端性质；2.内切酶用量：根据内切酶的单位和DNA用量而定。使用中一般以1μgDNA用2-3U酶进行酶切为宜；3.内切酶体积：不能超过反应体系的10%，因内切酶中含50%甘油，体系中甘油超过5%会抑制内切酶的活力：4.操作条件：反应体系配置应在冰上进行；防止操作中对内切酶的污染；5.DNA纯度：作为底物，DNA应该具备一定的纯度，不能含酚、氯仿、乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均在不同程度影响酶的活性
酶切反应注意事项 1. 识别位点：注意选择适合的识别位点和形成的末端性质； 2. 内切酶用量：根据内切酶的单位和DNA用量而定。使用 中一般以1 µg DNA用2-3U酶进行酶切为宜； 3. 内切酶体积：不能超过反应体系的10%，因内切酶中含 50%甘油，体系中甘油超过5%会抑制内切酶的活力； 4. 操作条件：反应体系配置应在冰上进行；防止操作中对内 切酶的污染； 5. DNA纯度：作为底物，DNA应该具备一定的纯度，不能 含酚、氯仿、乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均在 不同程度影响酶的活性