《遗传与分子生物学实验》课程教学资源（讲义）碱变性法小量制备质粒DNA和DNA酶切

实验十五碱变性法小量制备质粒DNA和DNA酶切

实验十五 碱变性法小量制备质粒 DNA和DNA酶切

基因克隆的技术路线ForeignDNA载体目的基因regionof interestgene forPlasmidEcoRIantibioticEcORIresistanceEcoRI体外连接EcoRIEcoRI（杂合DNA）重组子Stickyends转化Hybridization+DNAligaseRecombinant受体细胞DNADNAinsertionBacteria筛选阳性克隆Bacteria platted on mediumBacterialcellchromosome+antabioticCloningOnlybacteria containing大量扩增，获得子代DNArecombinantDNAgrowCulture!CloneDNA凡purification品自的基因在原核细胞中表达Cloninginto a plasmid

目的基因 载体 体外连接 重组子（杂合DNA） 转化 受体细胞 筛选阳性克隆 大量扩增，获得子代DNA 基因克隆的技术路线 目的基因在原核细胞中表达

1、质粒DNA的提取

1、质粒DNA的提取

一．实验目的及背景质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶

一．实验目的及背景  质粒是染色体外的DNA分子，大小可为 1kb到200kb。  大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合 环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细 菌内的共生型遗传因子。  其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制 和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶

质粒特点质粒能在细菌中垂直遗传并月赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子1952年由Lederburg正式命名为质粒

质粒特点  质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞 一些表型，是比病毒更简单的原始生命。  质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到 雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子.  １９５２年由Lederburg正式命名为质粒

质粒类型质粒按复制方式分为两种类型，松弛型质粒和严紧型质粒1.松弛型质粒松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝

质粒类型  质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒 和 严紧型质粒  1.松弛型质粒 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白， 完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白 质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白 质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存 在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝

2.严紧型质粒严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加

2.严紧型质粒  严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白， 质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成 抑制剂来增加

质粒的应用大多数基因工程使用松弛型质粒严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值

质粒的应用  大多数基因工程使用松弛型质粒。  严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒 害致死的基因。  质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细 菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运 载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值

本实验目的本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法

本实验目的  本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法

分离质粒DNA方法从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的碱变性法；煮沸法：SDS法；羟基磷灰石层析法等各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高，提取的质粒DNA可用于酶切连接与转化

分离质粒DNA方法  从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的  碱变性法；  煮沸法；  SDS法；  羟基磷灰石层析法等  各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、 碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法 既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切, 连接与转化