外源基因在大肠杆菌中的高效表达(a)An inducible geneRegutatory chemical....switchesGene normallyoffthegene onGenePromoterXTranscriptsNotranscription(a) A strong promoterGeneTranscriptionufStrongpromoter3R88TranslationRNumeroustranscripts0(b)AweakpromoterNumerousproteinGenemoleculesTranscriptionWeakpromoterTranslationRelatively fewtranscriptsLownumberofprotein molecules
外源基因在大肠杆菌中的高效表达
一：实验目的1.掌握外源基因在大肠杆菌中表达的特点和方法。2.复习SDS-PAGE的制备及其分离蛋白的原理。实验原理二.大肠杆菌表达体系1.基因表达调控的分子机制清楚2.使用安全，有多种适用的寄主菌株和载体；3.多数克隆的外源基因都可高效表达：4.培养方便、操作简单、成本低，易于批量生产。不足在大肠杆菌中表达的蛋白可能缺少特定等翻译后加工常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象
一．实验目的 1.掌握外源基因在大肠杆菌中表达的特点和方法。 2.复习SDS-PAGE的制备及其分离蛋白的原理。 不足 在大肠杆菌中表达的蛋白可能缺少特定等翻译后加工， 常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 1. 基因表达调控的分子机制清楚； 2. 使用安全，有多种适用的寄主菌株和载体； 3. 多数克隆的外源基因都可高效表达； 4. 培养方便、操作简单、成本低，易于批量生产。 二．实验原理 大肠杆菌表达体系
三：大肠杆菌表达的一般流程获得目的基因月→准备表达载体一→将目的基因插入表达载体中（测序验证）常用表达载体：具有以下几种元件：1.可控转录的启动子；类型：Plac,Ptac,PT7,PT5,eto2.转录调控序列（转录终止子，核糖体结合位点）；3.一个多克隆限制酶切位点；4.选择标志的编码序列；类型：AmpR,KanR,eto5.宿主体内自主复制的序列。融合表达蛋白标签：GST,6xHis,MBP,GFP,etcpGEX系列(tacpromoterGST融合表达）pET系列(T7 promoter, 6XHis)pQE系列(T5 promoter, 6XHis)
三．大肠杆菌表达的一般流程 获得目的基因 → 准备表达载体 → 将目的基因插 入表达载体中（测序验证） 常用表达载体： 融合表达蛋白标签: GST, 6xHis, MBP, GFP, etc pGEX系列 (tac promoter, GST融合表达) pET系列 (T7 promoter, 6XHis) pQE系列 (T5 promoter, 6XHis) 类型: Plac, Ptac, PT7, PT5, etc 具有以下几种元件： 1. 可控转录的启动子； 2. 转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； 3. 一个多克隆限制酶切位点； 4. 选择标志的编码序列； 5. 宿主体内自主复制的序列。 类型: AmpR , KanR , etc
原核生物的基因转录调控-乳糖操纵子P,lacTiacRepressorActivatorbinding sitebinding site(operator)DNAlacBACPromoterRNANOlacmRNANOP-laclTiaclPolymeraselactose阻遏物DNAlaclGeneofyourinterestsPromoterRNAP.laclTiaclPolymeraselacmRNALactose去阻遏Lactose
原核生物的基因转录调控-乳糖操纵子 Lactose NO lactose NO lac mRNA Lactose RNA Polymerase RNA Polymerase lac mRNA Gene of your interests 阻遏物 去阻遏
PharmaciapGEX-6P-3(27-4599-01)多克隆限制酶切位点PreScissionProteaseILeuGlu Val LeuPheGlnGly ProlLeu Gly Ser Pro Asn SerArg Val Asp Ser Ser Gly ArgCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTGGGATCCCCGAATTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGCSallBamHIEcoRINotiSmalXholTth1111AatilN'GSThioneS-transferaseitathPtacaAmprBspMIpSj10ABam7Stop7PstIPGEX~4900bpNarlAWNIlac/qEcoRVP4.5BssH IIApalPBR322BstEIllMlu I自主复制序列
Pharmacia lacIq 多克隆限制酶切位点 Ptac N’ GST Ampr 自主复制序列
Qiagen工三aEI室PT5lacOlacORBSATG6xHisFXa Recognition SiteMCSStopCodonsPT5lacoPT5:T5promoterN'6xHislac O:lacoperatorAmprRBS:Ribosome-bindingsiteodATG:Start codonPQE-30Xa6xHis:6xHistagsequence3.5kbFXaRecognitionSite:FactorXaProteaserecognitionsiteMcS:Multiplecloning siteStop Codons:In all3 readingframesColElColE1:Col E1originof replicationAmpicillin:Ampicillin resistance
PT5: T5 promoter lac O: lac operator RBS: Ribosome-binding site ATG: Start codon 6xHis: 6xHis tag sequence FXa Recognition Site: Factor Xa Protease recognition site MCS: Multiple cloning site Stop Codons: In all 3 reading frames Col E1: Col E1 origin of replication Ampicillin: Ampicillin resistance Qiagen PT5 lacO N’ 6x His Ampr
NovagenXhoI(158)Not I(166)PT7Eag (166)pET-28a(+) sequence landmarksHind Ill(173)T7promoter370-386Sal l(179)Sacl(190)369laclT7transcription startEcoRI(192)His?Tag coding sequence270-287BamHi(198)Nhe l(231)Bpu1102l(80)T7Tag coding sequence207-239NdeI(238)N'6x HisMultiple cloning sitesDralll(5127)NcoI(296)Xbal(335)(BamH I-Xho I)158-203BglIl(401)His-Tag coding sequence140-157Kanr1 origin (4903-5358)SgrA I(442)T7terminator26-72Sph (598)lacIcoding sequence773-18523286pBR322originKan(3995-4807)Kan coding sequence3995-4807Pvu I(4426)Sgfl(4426)f1 origin4903-5358Sma I(4300)Mlu(1123)Themaps for pET-28b(+)and pET-28c(+)lacl (773-1852)Bcl I(1137)are the same as pET-28a(+) (shown) withClal(4117)thefollowing exceptions: pET-28b(+) is aBstEI(1304)Nru I(4083)5368bpplasmid;subtract1bpfromeachsitepET-28a(+)Apal(1334)beyond BamH Iat 198.pET-28c(+) isa(5369bp)5367bpplasmid:subtract2bpfromeachsite/BssHIl(1534)beyondBamH Iat198Eco57(3772)ECORV(1573)Hpa(1629)AwN I(3640)or(32286PshAI(1968)BssSl(3397)BspLU111(3224)Bgl l(2187)Sapl(3108)FspI(2205)Bst1107l(2995)Psp5ll(2230)Tth111l(2969)
Novagen PT7 lacI N’ 6x His Kanr
三，大肠杆菌表达的一般流程获得自的基因→准备表达载体→将目的基因插入表达载体中（测序验证）→转化表达宿主菌常用宿主菌种类BL21(DE3)pLysS：蛋白酶缺陷型，自身表达T7RNApolymerase，适用pET系列等带T7启动子的载体M15/SG13009：自身表达T5RNApolymerase,适用pQE系列等带T5启动子的载体Rosetta2：补充大肠杆菌缺之的七种稀有密码子对应的tRNA提高外源基因的表达水平Origami2：帮助目的蛋白形成二硫键，促进蛋白可溶性及表达活性
三．大肠杆菌表达的一般流程 获得目的基因 → 准备表达载体 → 将目的基因插 入表达载体中（测序验证）→ 转化表达宿主菌 常用宿主菌种类 BL21(DE3)pLysS : 蛋白酶缺陷型, 自身表达T7 RNA polymerase, 适用pET系列等带T7启动子的载体 M15/SG13009 : 自身表达T5 RNA polymerase, 适用 pQE系列等带T5启动子的载体 Origami 2: 帮助目的蛋白形成二硫键，促进蛋白可 溶性及表达活性 Rosetta 2: 补充大肠杆菌缺乏的七种稀有密码子对 应的tRNA,提高外源基因的表达水平
三：大肠杆菌表达的一般流程获得目的基因→准备表达载体→将目的基因插入表达载体中（测序验证）→转化表达宿主菌诱导外源蛋白的表达IPTG（异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷）1.乳糖的类似物2.不被细菌分解，性质稳定3.能在缺乏lacY基因下而有效地被运送诱导条件：1.IPTG浓度,0.1mM~1mM2.诱导温度，20℃～37℃3.诱导时间，2小时～20小时
三．大肠杆菌表达的一般流程 → 诱导外源蛋白的表达 获得目的基因 → 准备表达载体 → 将目的基因插 入表达载体中（测序验证）→ 转化表达宿主菌 1. 乳糖的类似物 2. 不被细菌分解,性质稳定 3. 能在缺乏lacY基因下而有效地被运送 IPTG （异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷) 诱导条件: 1. IPTG 浓度, 0.1mM～1mM 2. 诱导温度, 20oC ～ 37oC 3. 诱导时间，2小时～20小时
三，大肠杆菌表达的一般流程获得目的基因→准备表达载体一→将目的基因插入表达载体中（测序验证）→转化表达宿主菌诱导外源蛋白的表达表达蛋白的分析→扩增、纯化、进一步检测四：实验器材及试剂器材：恒温摇床，各种量程移液器，电泳仪，蛋白电泳槽等试剂：LB培养基，IPTG100mM10%SDS-PAGE凝胶，上样缓冲液，电泳缓冲液，染色液，脱色液等
三．大肠杆菌表达的一般流程 → 诱导外源蛋白的表达 → 表达蛋白的分析 获得目的基因 → 准备表达载体 → 将目的基因插 入表达载体中（测序验证）→ 转化表达宿主菌 → 扩增、纯化、进一步检测 四．实验器材及试剂 器材：恒温摇床，各种量程移液器，电泳仪，蛋白电泳槽等 试剂：LB培养基，IPTG 100mM, 10％SDS-PAGE凝胶，上样缓冲液 ， 电泳缓冲液，染色液，脱色液等