实验八脂质体介导的细胞转染实验
脂质体介导的细胞转染实验 实验八 1
废门大王XiamenUniversity常用的哺乳动物细胞基因转移方法一
常用的哺乳动物细胞基因转移方法 2
常用的重组蛋白表达系统酵母细胞大肠杆菌昆虫细胞哺乳动物细胞0-1%0-60%0-10%0-30%产率（以干重计算）++蛋白酶消化糖基化分泌+-折叠+-+磷酸化酰基化酰胺化3
大肠杆菌 酵母细胞 昆虫细胞 哺乳动物细胞 产率（以干重计算） 0-60% 0-10% 0-30％ 0-1% 蛋白酶消化 +/- +/- + + 糖基化 - + + + 分泌 +/- + + + 折叠 +/- +/- + + 磷酸化 - + + + 酰基化 - + + + 酰胺化 - - + + 常用的重组蛋白表达系统 3
常用的基因转移方法RetroviralVectorAdenoviralVectorNonviral VectorDNACapsidEnvelopeLipPlasmidReverseTranscriptase非病毒载体RNADNAGenomeGenome（化学或物理方法）CellMembrane脂质体转染Receptoocepto磷酸钙转染电穿孔技术Endosome显微注射+山TherapeuticProtein.福病毒载体RibosomeRNADNA整合型病毒载体NuclearRNaseHMembeane非整合型病毒载体(dinsolved)DNATherapeutieHost-CellTherapeuticNuclearGeneGeneGenomemRNAPoreTherapeuticGene
常用的基因转移方法 非病毒载体 (化学或物理方法) 脂质体转染 磷酸钙转染 电穿孔技术 显微注射 。 病毒载体 整合型病毒载体 非整合型病毒载体 4
外源基因在细胞中的表达方式瞬时表达稳定表达获得稳定表达外源基因目的快速分析的细胞克隆整合未整合外源DNA存在状态随宿主细胞本身基因组随细胞分裂而稀释至丢表达维持时间失，一般可表达一样复制，转录，翻译48~72小时并被稳定遗传筛选办法抗生素抗性抗生素抗性5
瞬时表达 稳定表达 目的 快速分析 获得稳定表达外源基因 的细胞克隆 外源DNA存在状态 未整合 整合 表达维持时间 随细胞分裂而稀释至丢 失，一般可表达 48～72小时 随宿主细胞本身基因组 一样复制，转录，翻译， 并被稳定遗传 筛选办法 抗生素抗性 抗生素抗性 外源基因在细胞中的表达方式 5
脂质体转染的基本原理脂质体（liposome）是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，是一种人工生物膜。可用于外源物质进入细胞的载体。分散于水相并搅动后，磷脂分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相。而亲水头部暴露在水相。从而形成具有双分子层结构的的封闭囊泡，直径25~1000nm。碳脂分子脂质体亲水基团疏水基团疏水端搅拌后亲水端水磷脂分子脂质体6
脂质体转染的基本原理 脂质体（liposome）是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层， 是一种人工生物膜。可用于外源物质进入细胞的载体。 分散于水相并搅动后，磷脂分子的疏水尾部倾向于聚集在一起， 避开水相。而亲水头部暴露在水相。从而形成具有双分子层结构的 的封闭囊泡，直径 25~1000 nm。 6
脂质体转染的基本原理Nonviral VectorDNA阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过upePlasmid静电作用将DNA分子包裹，形成DNA/脂复合体。该复合体可被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜融合或细胞的内吞作用，也可通过直接渗透作用，将DNA传递进入细胞。Lipid-MediatedTransfectioninMammalianCellsPlasmid一EndocytosisVectorDNAEndosomeDNA-LipidReleasedComplexDNACellLipofectionTherapeubeReagentMembranecen
脂质体转染的基本原理 阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过 静电作用将DNA分子包裹，形成DNA/脂复合体。 该复合体可被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜 融合或细胞的内吞作用，也可通过直接渗透作用，将 DNA传递进入细胞。 7
哺乳动物表达质粒pcDNA3：目前应用较广的真核质粒表达载体之一。主要特征：用于表达外源基因的CMV启动子：用于筛选的新霉素抗性基因：用于外源基因克隆的多克隆酶切位点（MCS）：提供转录终止信号的牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号序列。衍生出多种不同用途的载体，如含不同附加多肽（His、myc及V5等）以利于蛋白质检测或纯化；含不同选择标记Hyromycin和zeocin等）。酒BglllSp60电NdelBGHCMVPcmvAmpNrulBglllSmalEGFPColE1pN31-EGFPpcDNA3Tth1111Pvul5.4 kbSV40pABGHpAEcoRI11NeoSV40ColE1A-150228ThereisanATGupstreamBsmloftheXba1site8
pcDNA3：目前应用较广的真核质粒表达载体之一。 主要特征： 用于表达外源基因的CMV启动子；用于筛选的新霉素抗性基因；用于 外源基因克隆的多克隆酶切位点（MCS）；提供转录终止信号的牛生 长激素(BGH)多腺苷酸化信号序列。 衍生出多种不同用途的载体，如含不同附加多肽（His、myc及V5等） 以利于蛋白质检测或纯化；含不同选择标记Hyromycin和zeocin等）。 哺乳动物表达质粒 8
废门大子XiamenUnivereity实验操作本次实验的目的：学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法一一脂质体介导的转染9
实 验 操 作 本次实验的目的： 学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法— —脂质体介导的转染。 9
主要实验材料：293细胞（人肾上皮细胞系）增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的哺乳动物细胞表达质粒，pN3I-EGFP，报告基因表达质粒DMEM基础培养基DMEM完全培养基（10%胎牛血清，链霉素/青霉素脂质体转染试剂10
主要实验材料： 293细胞（人肾上皮细胞系） 增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的哺乳动物细 胞表达质粒，pN31-EGFP，报告基因表达质粒 DMEM基础培养基 DMEM完全培养基（10%胎牛血清，链霉素/青 霉素） 脂质体转染试剂 10