g,1.06o 中华人民共和国国家标准 Ew5750-209 生活饮用水标准检验方法 微生物指标 Standard examination methods for drinking water- Microbiological parameters 2006-12-29发布 2007-07-01实施 中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会 发布
GB/T5750.12-2006 目 次 前言 菌落总数 .1 总大肠菌群 3 2 3耐热大肠菌群. 14 4大肠埃希氏菌. 5贾第鞭毛虫 6 隐孢子虫 .30
GB/T5750.12-2006 前言 GB/T5750(生活饮用水标准检验方法》分为以下部分： 一总则： —水样的采集和保存： 一水质分析质量控制： 感官性状和物理指标 无机非金属指标； 一金属指标； 一—一有机物综合指标， 一有机物指标； 农药指标 一消毒副产物指标： 一消毒剂指标： 微生物指标， 放射性指标 本标准代替GB/T5750一1985生活饮用水标准检验法》第二篇中的细菌总数、总大肠菌群 本标准与GB/T5750一1985相比主要变化如下： 一依据GB/T1.1一2000标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》调整了结构； 一增加了生活饮用水中耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、贾第鞭毛虫、隐孢子虫4项指标的？个检 验方洪 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准负责起草单位：中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所。 本标准参加起草单位：中山大学、黑龙江省疾病预防控制中心，河北省疾病预防控制中心、北京市疾 病预防控制中心，深圳市疾病预防控制中心，澳门自来水公司、广州市自来水公司。 本标准主要起草人：金银龙、陈西平、周淑玉、孙宗科，宋宏。 本标准参加起草人：晓杰、张淑红、张雅婕、丁培、薛金荣、余淑苑、范晓军，章诗芳 本标准于1985年8月首次发布.本次为第一次修订
GB/T5750.12-2006 生活饮用水标准检验方法 微生物指标 1菌落总数 1,1平皿计数法 1.1.1范围 本标准规定了用平皿计数法测定生活伙用水及其水源水中的菌落总数。 本祛适用于生活饮用水及其水源水中菌落总数的测定。 1.1.2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 1.1.2.1 菌落总数 standard plate-count bacteria 水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1mL水样所含菌落的总数。 1.1.3培养基与试别 1.1.3.1营养琼脂 1.1.3.1.1成分 蛋白胨 10g B 牛肉膏 3 g 氯化钠 A 琼脂 10g~20g 蒸馏水 1000mL 1.1.3.1.2制法：将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4~7.6，分装于玻璃容器中（如用含杂 质较多的琼脂时，应先过滤)，经103.43kPa(121℃，151b)灭菌20min,储存于冷暗处备用。 1.14位器 1.1.4.1 高压燕汽灭菌器 1.1.4.2 干热灭菌箱。 1.1.4.3培养箱36℃士1℃. 1.1.4.4电炉 11.45天平 1.1.4.6 冰箱 1.1.4.7放大镜或堕落计数器 1.1.4.8pH计或精密pH试纸 1.1.4.9灭菌试管、平皿（直径9cm)、刻度吸管、采样瓶等 115 检验步绿 1.1.5.1生活饮用水 1.1.5.1.1以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15mL 已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验 时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照 1,1.51.2待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36℃士1℃培养箱内培养48h,进行菌落计数
GB/T5750.12-2006 即为水样1mL中的茵落总数 1.1.5.2水源水 1.1.5.2.1以无菌操作方法吸取1mL充分混匀的水样，注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀 成1·10稀释液。 1.1.5.2.2吸取1：10的稀羅液1mL注人感有9mL灭第生理盐水的试管中.混匀成1；100稀影 液。按同法依次稀释成1：1000,1：10000稀释液等备用。如此递增稀释一次，必须更换一支1ml 灭用吸管。 1.1.5.2.3用灭菌吸管取未稀释的水样和2个~3个适宜稀释度的水样1mL,分别注入灭茵平皿内。 以下操作同生活饮用水的检验步骤。 1.1.6菌落计数及报告方法 作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数 后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿 有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片 状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌整 数。然后再求该稀释度的平均菌落数 1,1.7不同稀释度的选择及报告方法 1.1.7.1首先选择平均菌落数在30一300之间者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范 国时，测将该菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例1）。 1.1.7,2若有两个稀释度，其生长的菌 落数均在 300之间，则祝二者之比值来决定，若其比值小于 2应报告两者的平均数（如表】中实例2）。若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总数（如表1中实例 3)。若等于2亦报告其中稀释度较小的南落数（见表1中实例4）。 1.1,7.3若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告 之（见表1中实例5） 1.1.7.4若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报 告之（见表1中实例6）。 1.1.7.5若所有稀释度的平均南落数均不在30~300之间，则应以最接近30或300的平均菌落数乘 以稀释倍数报告之（见表1中实例7）， 1.1.7.6 若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告之。 1.1.7.7如果所有平板上都苗落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其 中2个平板1cm2中的南落数，除2求出每平方厘米内平均菌落数，乘以皿底面积63.6cm2,再乘其稀 经数作报告 1.1.7.8 菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两 位有效数字后面的数值，以四舍五人方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示（见表 1“报告方式”栏)。 表1稀释度选择及菌落总数报告方式 实例 不同稀释度的平均声落数 两个稀释度 菌落总数 10-1 10-2 10-1 菌落数之比 (CFU/mL) 报告方式/(CFU/ml) 1365 164 20 16400 16000或1.6×10 2 2760 295 46 1.6 37750 38000或3.8×10 2890 271 60 2.2 27100 2700或2.7×10 150 30 2 1500 1500或1.5×103
GB/T5750.12-2006 表1（续） 不可稀释度的平均菌落数 丽个稀程度 腹落范数 实创 报告方式/(CU/mL) 10-1 10-2 10-3 菌落数之比(CU/mL》 多不可计 1650 513 513000 510000或5.1×10' 29 11 270 270或2.7×10 7 多不可计 305 12 30500 31000或3.1×10 2总大肠群 2.1多管发酵法 2.1.1范围 本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。 本法适用于生活伙用水及其水源水中总大肠菌群的测定。 2.1.2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 2.1.2.1 总大肠苗群total coliforms 总大肠菌群指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢 杆菌。 2.1.3培养基与试剂 2.1.3.1乳糖蛋白陈培养液 2.1.3.1.1成分 A蛋白陈 10g B牛肉膏 3 g C到糖 D氯化钠 5 g E溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1 mL F蒸馏水 1000mL 2.1.3.1.2制法 将蛋白胨、牛肉膏，乳及氯化钠溶于馏水中，调整pH为7.2~7.4，再加人1mL16g/L的澳甲 阶紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，68.95kPa(115℃，10Ib)高压灭菌20min,贮存于 冷暗处备用。 21,3.2二倍浓缩乳糖蛋白陈培养液 按上述乳精蛋白陈培养液(2.1.3.1)，除蒸馏水外，其他成分量加倍。 2.1.3.3伊红美蓝培养基 2.1.3.3.1成分 10g 10g C磷酸氢二钾 2g D琼脂 20g~30g 任森服的心 1000ml 20mL
GB/T5750.12-2006 G类蓝水溶液(5g/L) 13 mL 2.1.3.3.2制法 将蛋白胨，瞬酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH为7.2，加人乳糖，混匀后分装，以68.95kP (115℃，101b)高压灭菌20min,临用时加热融化琼脂，冷至50℃~55℃，加入伊红和美蓝溶液，混匀， 倾注平皿 2.1.3.4革兰氏染色液 2.1.3.4.1结品紫染色液 A成分 结晶紫 18 b乙醇(95%，体积分数) 20 mL c草酸铵水溶液(10g/L) 80 mL B制法：将结品紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 注：结品紫不可用龙胆紫代，者是纯品，后者不是单一成分，易出现假阳性。结品紫溶液敢置过久会产生沉淀， A成分： 】g b碘化钾 2g c蒸馏水 300mL B制法：将碘和碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水。 2.1.3.4.3脱色剂 乙醇(95%，体积分数) 2.1.3.4.4沙黄复染液 A成分， a沙黄 0.25g b乙醇(95%，体积分数 10 mL c蒸馏水 90 mL B制法：将沙黄溶解于乙醇中，待完全溶解后加人蒸馏水。 2.1.3.4.5染色法 A将培养18h~24h的培养物涂片 B将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1mi,水洗。 C滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗。 D滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止，约305，水洗 E滴加复染剂，复染1min,水洗，待干，镜检 2.1.4仪器 21.4.1挤浆箱，36℃+1℃ 2.1.4.2 冰箱：0℃一4℃. 2.1.4.3天平。 2.1.4.4显微镜. 2.1.4.5平m:直径为9cm 2.1.4.6 试管 2.1.4.7分度吸管：1mL,10mL。 4
GB/T5750.12-2006 2.1.4.8形瓶 2.1.4.9小倒管 2.1.4.10载玻片 2.1.5检验步 2.1.5.1乳糖发酵试验 2.1.5.1.1取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取1mL水样接种到10mL单料 乳糖蛋白陈培养液中，另取1mL水样注人到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL(即0.1mL水 样)注入到10mL单料乳糖蛋白陈培养液中，每一稀释度接种5管。 对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接种5份10mL水样双料培养基， 每份接种10mL水样。 2.1.5.1.2检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1,0.1,0.01mL甚至0.1,0.01 0.001mL,每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀 释后，取1mL接种，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌刻度吸管 2.1.5.1.3将接种管置36℃士1℃培养箱内，培养24h士2h,如所有乳糖蛋白陈培养管都不产气产 酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。 2.1.5.2分离培养 将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36℃士1℃培养箱内培养18h~24h,观察 菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。 深紫黑色、具有金属光泽的菌落； 紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落： 淡紫红色、中心较深的菌落。 2.1.5.3证实试验 经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36℃士1℃培养箱中培 养24h土2h,有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。 2.1.6结果报告 根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN(most probable number,最可能数)检索表，报告每 100mL水样中的总大肠南群最可能数(MPN)值。5管法结果见表2,15管法结果见表3。稀释样品查 表后所得结果应乘稀释倍数。如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出。 表2用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数(MPN) 5个10mL管中阳性管数 最可能数(MPN) 0 16
GB/T5750.12-2006 表3总大肠菌群MPN检索表 (总接种量55.5mL,其中5份10mL水样，5份1mL水样，5份0.1mL水样) 接种量/mL 总大肠菌群 接种量/mL 总大肠菌卧 10 1 0.1 (MPN/100 mL 10 1 0.1 (MPN/100 mL) 0 <2 0 0 0 0 2 0 1 0 0 0 0 0 10 0 0 12 1 0 4 1 0 1 1 2 1 3 3 9 1 11 0 1 1 5 14 0 2 4 1 2 0 6 12 2 10 0 1 2 3 0 9 4 5 13 2 5 1 0 0 6 1 3 0 8 0 7 1 3 10 3 23 9 3 12 11 15 3 17 0 3 1 19 0 4 0 4 89 1 13 0 1 0 73 1 3 : 5 1 4 4 79 0 5 1 4 22 0 5 0 9 1 13 0 5 113 15 2 0 3 19 0 17 19 24
GB/T5750.12-2006 表3（续） 接种量/mL 总大肠菌群/ 接种盘/mL 总大肠菌群/ 10 1 0.1 (MPN/100 mL) 0.1 (MPN/100 mL) 2 0 0 0 0 0 12 20 23 1 3 0 14 12 14 20 17 2 9 2 1 3 2 22 2 3 12 3 3 公 14 3 2 17 20 4 3 16 4 0 15 2 17 02 3 3 25 g 0 17 3 5 25 2 2 32 37 2 5 29 32