《分子生物学技术》实验教学大纲 1.实验课程号 2,课程属性：选修 3.实验属性：非独立设课 4.学时学分：18学时 5.实验应开学期：春季 6.先修课程：分子生物学 一、课程的性质与任务 分子生物学技术是兽医专业食品卫生检验方向的一门重要选修课。分子生物学技术实验 是分子生物学技术重要教学环节之一。通过实验，一方面使学生进一步加深对分子生物学 技术基本理论的理解，巩固所学的理论知识；另一方面，让学生了解分子生物学技术的 些研究方法，培养学生的实践操作能力，提高学生分析、解决问题的能力，为学好分子生 物学技术及相关课程发挥相辅相成的作用。 二、实验的目的与基本要求 分子生物学技术实验综合性强，涉及面广，基本操作全面，教学中应达到以下基本目的 和要求： 1能通运用所学知识，切实领会实验原理 2,掌握基本的实验方法和技能，熟练操作步骤，提高学生的实践操作能力： 3.训练学生独立观察、思考的习惯，能正确预测、分析实验中可能出现的结果，培养 学生科学的思维方法和创新能力； 4·严格要求学生，认真对待实验，精心知识，独立进行实验操作，独立完成实验报 告，使学生逐步养成严道的学风，认真细致的工作态度，为以后的科学技术工作奠定基 础。 三、实验考核方式及办法 (一)总则：实验课考核成绩占该门课程的40%，若实验课考核成绩达不到60分，则不 能参加该门课程的期终考试。 (二)考核内容及成绩计分方法 1.课堂表现(40分) ①考勤：迟到或早退每次扣5分，旷课一次扣0分并交学工组老师处理
《分子生物学技术》实验教学大纲 1．实验课程号： 2．课程属性：选修 3．实验属性：非独立设课 4．学时学分：18 学时 5．实验应开学期：春季 6．先修课程：分子生物学 一、课程的性质与任务 分子生物学技术是兽医专业食品卫生检验方向的一门重要选修课。分子生物学技术实验 是分子生物学技术重要教学环节之一。通过实验，一方面使学生进一步加深对分子生物学 技术基本理论的理解，巩固所学的理论知识；另一方面，让学生了解分子生物学技术的一 些研究方法，培养学生的实践操作能力，提高学生分析、解决问题的能力，为学好分子生 物学技术及相关课程发挥相辅相成的作用。 二、实验的目的与基本要求 分子生物学技术实验综合性强，涉及面广，基本操作全面，教学中应达到以下基本目的 和要求： 1．能通运用所学知识，切实领会实验原理； 2．掌握基本的实验方法和技能，熟练操作步骤，提高学生的实践操作能力； 3．训练学生独立观察、思考的习惯，能正确预测、分析实验中可能出现的结果，培养 学生科学的思维方法和创新能力； 4．严格要求学生，认真对待实验，精心知识，独立进行实验操作，独立完成实验报 告，使学生逐步养成严谨的学风，认真细致的工作态度，为以后的科学技术工作奠定基 础。 三、实验考核方式及办法 (一)总则：实验课考核成绩占该门课程的 40％，若实验课考核成绩达不到 60 分，则不 能参加该门课程的期终考试。 (二)考核内容及成绩计分方法 1．课堂表现(40 分) ① 考勤：迟到或早退每次扣 5 分，旷课一次扣 l0 分并交学工组老师处理
2课堂纪律：参照实验守则，违反纪律每次扣10分并交学工组老师处理。 ③卫生：课堂乱涂画者，每次扣10分，并清除之，课后卫生不符要求擅自离去者，每 人每次扣5分。 2.实验报告成绩60分) 实验报告应独立、按时完成，缺交一次扣10分，抄袭他人作业及被抄袭者一律记0 分。 四、实验项目一览表 分子生物学技术课程实验项目一览表 实验名称 实验实验适用 类型要求 专业 学时 1分子生物学常用仪器的使用和保养综合选修食品卫生检验4 2 动物组织中总DNA的提取与纯度鉴定综合选修食品卫生检验 4 3 PCR扩增 综合选修食品卫生检验 4 4 实验四DNA的凝胶电泳 综合选修 食品卫生检验 6 五、实验项目的内容 实验一分子生物学常用仪器的使用方法与保养 1.本次实验的目的和要求 (1)熟悉和掌握分子生物学常用仪器的使用方法。 (2)了解和掌握分子生物学常用字仪器的保养方法。 2.实验内容 (1)分子生物学常用仪器的使用方法 (2)分子生物学常用仪器的保养方法 (3)分子生物学常用仪器使用时的注意事项 3.需要的仪器 (1)PCR扩增仪 (2)冷冻离心机 (3)紫外分光光度计
②课堂纪律：参照实验守则，违反纪律每次扣 10 分并交学工组老师处理。 ③卫生：课堂乱涂画者，每次扣 10 分，并清除之，课后卫生不符要求擅自离去者，每 人每次扣 5 分。 2．实验报告成绩(60 分) 实验报告应独立、按时完成，缺交一次扣 10 分，抄袭他人作业及被抄袭者一律记 0 分。 四、实验项目一览表 分子生物学技术课程实验项目一览表 序 号 实验名称 实验 类型 实验 要求 适用 专业 学时 1 分子生物学常用仪器的使用和保养 综合 选修 食品卫生检验 4 2 动物组织中总 DNA 的提取与纯度鉴定 综合 选修 食品卫生检验 4 3 PCR 扩增 综合 选修 食品卫生检验 4 4 实验四 DNA 的凝胶电泳 综合 选修 食品卫生检验 6 五、实验项目的内容 实验一 分子生物学常用仪器的使用方法与保养 1．本次实验的目的和要求 （1）熟悉和掌握分子生物学常用仪器的使用方法。 （2）了解和掌握分子生物学常用字仪器的保养方法。 2．实验内容 （1）分子生物学常用仪器的使用方法 （2）分子生物学常用仪器的保养方法 （3）分子生物学常用仪器使用时的注意事项 3．需要的仪器 （1）PCR 扩增仪 （2）冷冻离心机 （3）紫外分光光度计
(4)凝胶成像系统 (5)超低温冰箱 (6)低温摇床 4.实验步骤 (1)先听老师讲解各仪器的使用方法、保养和注意事项。 (2)操作使用。 5.教学方式 教师讲解，学生独立操作。 6.考核要求 掌握常用仪器的使用方法、保养及其注意事项 7.实验报告要求 (1)了解实验目的和要求。 (2)写出常用仪器的使用方法和注意事项。 实验二动物组织中总DNA的提取与纯度鉴定 1.本次实验的目的和要求 学习动物DNA的提取方法和原理，以及DNA纯度的鉴定技术。 2.实验原理 在DNA的提取过程中，利用去污剂如SDS(十二烷基硫酸钠)使组织细胞裂解，并破坏蛋 白质的二级、三级结构；利用蛋白酶个水解蛋白质；变性的蛋白质及多糖，脂类等杂质通 过有机溶剂如苯酚/氯仿抽提而去除；再用氯仿抽提去除多余的酚；然后向含DNA的上清 液加无水乙醇使DNA分子发生凝聚（脱水），最后通过离心得到DNA沉淀。 3.需要的仪器和试剂 (1)仪器 高速离心机、离心管、微加热系统、移液枪、紫外分光光度计。 (2)试剂 DNA提取液，饱和苯酚，氯仿：异戊醇混合液，无水乙醇，蛋白酶，TE。 4.实验步骤
（4）凝胶成像系统 （5）超低温冰箱 （6）低温摇床 4．实验步骤 （1）先听老师讲解各仪器的使用方法、保养和注意事项。 （2）操作使用。 5．教学方式 教师讲解，学生独立操作。 6．考核要求 掌握常用仪器的使用方法、保养及其注意事项 7．实验报告要求 （1）了解实验目的和要求。 （2）写出常用仪器的使用方法和注意事项。 实验二 动物组织中总 DNA 的提取与纯度鉴定 1．本次实验的目的和要求 学习动物 DNA 的提取方法和原理，以及 DNA 纯度的鉴定技术。 2．实验原理 在 DNA 的提取过程中，利用去污剂如 SDS（十二烷基硫酸钠）使组织细胞裂解，并破坏蛋 白质的二级、三级结构；利用蛋白酶个水解蛋白质；变性的蛋白质及多糖，脂类等杂质通 过有机溶剂如苯酚/氯仿抽提而去除；再用氯仿抽提去除多余的酚；然后向含 DNA 的上清 液加无水乙醇使 DNA 分子发生凝聚（脱水），最后通过离心得到 DNA 沉淀。 3．需要的仪器和试剂 （1）仪器 高速离心机、离心管、微加热系统、移液枪、紫外分光光度计。 （2）试剂 DNA 提取液，饱和苯酚，氯仿：异戊醇混合液，无水乙醇，蛋白酶，TE。 4.实验步骤
(1)动物DNA的提取 ①取猪耳或其它组织器官约1.5g,洗干净.切碎，移至1.5ml离心管中 2加入DNA提取液0.5ml 3加入蛋白酶K15ml(蛋白酶K的浓度为10mg/ml),并充分混匀 ④放于45C摇床消化.转速120mp,以完全消化为准。 ⑤加入等体积饱和酚，充分摇匀.10000mp离心5分钟，取上清液。 6加入等体积氯仿/异戊醇混合液，充分混匀.10000mp离心5分钟，取上清液： ⑦加入2倍体积冰冷的无水乙醇，轻轻混匀，7000mp离心2分钟，弃去上清液。 8加入适量TE溶解。 (2)DNA纯度及含量测定 5.教学方式 教师讲解，在老师的指导下，学生动手操作。 6.考核要求 (1)掌握动物DNA的提取方法。 (2)掌握DNA的浓度测定和质量检测方法 7.实验报告要求 (1)掌握实验的原理和操作步骤 (2)对实验结果进行详细分析 实验三PCR扩增 1,本次实验的目的和要求 通过本实验的学习，使学生掌握PCR反应的基本原理和操作技术， 2.实验原理 聚合酶链式反应(PCR)的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量模板DNA、引物、 dNTP、耐热DNA聚合酶(Taq酶)和Mg2+等存在的情况下，经变性、退火和延伸若干个 循环后，DNA可扩增2n倍，其扩增倍数可用以下公式表示 Y=(1+x)n Y:DNA扩增倍数，X:扩增效率，n:循环次数
（1）动物 DNA 的提取 ①取猪耳或其它组织器官约 1.5g，洗干净，切碎，移至 1.5ml 离心管中。 ②加入 DNA 提取液 0.5ml ③加入蛋白酶 K 15ml（蛋白酶 K 的浓度为 10mg/ml），并充分混匀 ④放于 45℃摇床消化，转速 120 rmp，以完全消化为准。 ⑤加入等体积饱和酚，充分摇匀，10000 rmp 离心 5 分钟，取上清液。 ⑥加入等体积氯仿/异戊醇混合液，充分混匀，10000 rmp 离心 5 分钟，取上清液。 ⑦加入 2 倍体积冰冷的无水乙醇，轻轻混匀，7000 rmp 离心 2 分钟，弃去上清液。 ⑧加入适量 TE 溶解。 （2）DNA 纯度及含量测定 5．教学方式 教师讲解，在老师的指导下，学生动手操作。 6．考核要求 （1）掌握动物 DNA 的提取方法。 （2）掌握 DNA 的浓度测定和质量检测方法 7．实验报告要求 （1）掌握实验的原理和操作步骤 （2）对实验结果进行详细分析 实验三 PCR 扩增 1．本次实验的目的和要求 通过本实验的学习，使学生掌握 PCR 反应的基本原理和操作技术。 2.实验原理 聚合酶链式反应（PCR）的原理类似于 DNA 的天然复制过程。在微量模板 DNA、引物、 dNTP、耐热 DNA 聚合酶（Taq 酶）和 Mg2+等存在的情况下，经变性、退火和延伸若干个 循环后，DNA 可扩增 2n 倍，其扩增倍数可用以下公式表示： Y=（1+X）n Y：DNA 扩增倍数, X：扩增效率， n：循环次数
3.需要的仪器及试剂 (1)仪器 PCR热循环仪、台式冷冻离心机、离心管、移液枪和吸头。 (2)试剂 Taq DNA聚合酶，l0 xbuffer(PCR缓冲液，dNTP5,石蜡油，MgC2 4.实验步骤 (1)PcR反应体系(25u):以猪的氟烷基因的扩增为例。 反应物 体积(u) 母液浓度 ①ddh20 17.55 ②10 xbuffer 2.5 ③dNTPs 0.2 2mM 4④引物1 0.8 SuM ⑤引物2 0.8 5uM ⑥MgC2 1.5 25mM ⑦Taq聚合酶 0.25 Su/ul ⑧DNA模板 0.5 100ng/ul (2)PCR反应程序 ①94C预变性：4分钟 294C°变性：1分钟 364C退火：1分钟 循环35次 ④72C延伸：1分钟 572C后延伸：8分钟 6结束 5.教学方式
3.需要的仪器及试剂 （1）仪器 PCR 热循环仪、台式冷冻离心机、离心管、移液枪和吸头。 （2）试剂 Taq DNA 聚合酶，10×buffer（PCR 缓冲液，dNTPs，石蜡油，MgCl2 4.实验步骤 （1）PCR 反应体系（25ul）:以猪的氟烷基因的扩增为例。 反应物 体积（ul） 母液浓度 ①ddH2O 17.55 ②10×buffer 2.5 ③dNTPs 0.2 2mM ④引物 1 0.8 5uM ⑤引物 2 0.8 5uM ⑥MgCl2 1.5 25mM ⑦Taq 聚合酶 0.25 5u/ul ⑧DNA 模板 0.5 100ng/ul （2）PCR 反应程序 ①94℃预变性: 4 分钟 ②94℃变性: 1 分钟 ③64℃退火: 1 分钟 循环 35 次 ④72℃延伸: 1 分钟 ⑤72℃后延伸: 8 分钟 ⑥结束 5．教学方式
教师采用多媒体讲解，学生再动手操作。 6.考核要求 (1)掌握PCR反应的原理 (2)掌握PCR反应程序的编写 7.实验报告要求 (1)按要求撰写实验报告 (2)分析实验结果 实验四DNA的凝胶电泳 1.本次实验的目的和要求 学习和掌握DNA的凝胶电泳方法。 2.实验原理 带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳。DNA等生物大分子在一定的PH值条 件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中向相反电移动。 琼脂糖和聚丙烯酰胺作为支持介质的凝胶电泳应用最多，它们是分离，鉴定和纯化DNA 和RNA片段的主要方法。琼脂糖比聚丙烯酰胺的分辩率低，但其分离范围广，约2O0p~ 50kb的DNA通常在垂直水平装置上进行，聚丙烯酰胺分离小片段(5~500bp)的效果较 好，一般在垂直装置上进行。 3.需要的仪器及试剂 (1)仪器 移液器，电泳仪，电泳槽，凝胶成像系统 (2)试剂 琼脂糖，50×TAE,溴化乙锭，上样液 4.实验步骤 (1)用适明透胶将洗净，干燥的电泳凝胶床的两端开口封好。 (2)用电泳缓冲液在微波炉上溶解琼脂糖颗粒，熔化的琼脂糖溶液冷却至60C时，加入 溴化乙锭，其浓度为0.5 ul/mlI,充分混匀。 (3)在胶膜放置好梳子后，将温热凝胶倒入胶膜中，倒胶时避免产生气泡，胶厚度为3 5mm
教师采用多媒体讲解，学生再动手操作。 6．考核要求 （1）掌握 PCR 反应的原理 （2）掌握 PCR 反应程序的编写 7．实验报告要求 （1）按要求撰写实验报告 （2）分析实验结果 实验四 DNA 的凝胶电泳 1.本次实验的目的和要求 学习和掌握 DNA 的凝胶电泳方法。 2.实验原理 带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳。DNA 等生物大分子在一定的 PH 值条 件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中向相反电移动。 琼脂糖和聚丙烯酰胺作为支持介质的凝胶电泳应用最多，它们是分离，鉴定和纯化 DNA 和 RNA 片段的主要方法。琼脂糖比聚丙烯酰胺的分辩率低，但其分离范围广，约 200bp～ 50kb 的 DNA 通常在垂直水平装置上进行，聚丙烯酰胺分离小片段（5～500bp）的效果较 好，一般在垂直装置上进行。 3.需要的仪器及试剂 （1）仪器 移液器，电泳仪，电泳槽，凝胶成像系统 （2）试剂 琼脂糖，50×TAE，溴化乙锭，上样液 4.实验步骤 （1）用适明透胶将洗净，干燥的电泳凝胶床的两端开口封好。 （2）用电泳缓冲液在微波炉上溶解琼脂糖颗粒，熔化的琼脂糖溶液冷却至 60℃时，加入 溴化乙锭，其浓度为0.5ul/ml，充分混匀。 （3）在胶膜放置好梳子后，将温热凝胶倒入胶膜中，倒胶时避免产生气泡，胶厚度为 3～ 5mm
(4)凝胶固定后，小心移去梳子和胶带，将凝胶放入电泳槽。 (5)加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶表面1~2mm。 (6)将样品与上样缓冲液混合。 (7)用微量移液器将样品加入孔内。 (8)电泳槽通电，在60~100V恒压下电泳。 (9)电泳完成后切断电源，取出凝胶，放于凝胶成像系统下的观察、拍照。 5.教学方式 教师讲解，并指导学生操作。 6.考核要求 (1)掌握琼脂糖凝胶的制作方法 (2)掌握DNA的凝胶电泳方法 7.实验报告要求 (1)根据所学知识分析实验结果 (2)总结归纳本实验的注意事项 六、实验教材及主要参考资料 1.姜泊，张亚历，周殿元，分子生物学常用实验方法。人民军医出版社，1996 2,熊远著主编，猪生化及分子遗传实验导论。中国农业出版社，1999。 七、教改说明及其他 分子生物学技术实验共18学时，为了培养学生独立操作、提高综合分析问题的能力， 我们将4个独立实验设计成一个综合性实验：先了解仪器的使用，再提取动物的DNA,然 后再对DNA样品进行PCR扩增，最后进行电泳检测，这样既节省人力、物力，又使实验 之间增加了连贯性。 主撰人：黄生强 审核人： 分管教学院长： 2007年3月20日
（4）凝胶固定后，小心移去梳子和胶带，将凝胶放入电泳槽。 （5）加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶表面 1～2mm。 （6）将样品与上样缓冲液混合。 （7）用微量移液器将样品加入孔内。 （8）电泳槽通电，在 60～100V 恒压下电泳。 （9）电泳完成后切断电源，取出凝胶，放于凝胶成像系统下的观察、拍照。 5．教学方式 教师讲解，并指导学生操作。 6．考核要求 （1）掌握琼脂糖凝胶的制作方法 （2）掌握 DNA 的凝胶电泳方法 7．实验报告要求 （1）根据所学知识分析实验结果 （2）总结归纳本实验的注意事项 六、实验教材及主要参考资料 1．姜泊，张亚历，周殿元，分子生物学常用实验方法。人民军医出版社，1996。 2．熊远著主编，猪生化及分子遗传实验导论。中国农业出版社，1999。 七、教改说明及其他 分子生物学技术实验共 18 学时，为了培养学生独立操作、提高综合分析问题的能力， 我们将 4 个独立实验设计成一个综合性实验：先了解仪器的使用，再提取动物的 DNA，然 后再对 DNA 样品进行 PCR 扩增，最后进行电泳检测，这样既节省人力、物力，又使实验 之间增加了连贯性。 主撰人：黄生强 审核人： 分管教学院长： 2007 年 3 月 20 日
