第七章细胞融合与核移植
第七章 细胞融合与核移植
第一节细胞融合 细胞融合又称体细胞杂交 人细胞 鼠细胞 或超性杂交。 膜蛋百 膜蛋白 细胞融合 细胞融合一一在自发或人工诱 异核体 导下，两个不同基因型的细胞或原 生质体融合形成一个杂种细胞的现 象。包括： 荧光。标记 荧光·标记 的鼠膜蛋白。 。的人膜蛋白 抗体A 抗体 1.精子和卵子的融合 时问=0分钟 37℃培养 2.正常情况下不能进行有性杂交的 异种细胞，融合成杂种细胞 (hybrid cell)。 时间=40分钟
第一节 细胞融合 ⚫ 细胞融合又称体细胞杂交 或超性杂交。 ⚫ 细胞融合－－在自发或人工诱 导下，两个不同基因型的细胞或原 生质体融合形成一个杂种细胞的现 象。包括： 1.精子和卵子的融合 2.正常情况下不能进行有性杂交的 异种细胞，融合成杂种细胞 （hybrid cell）
1957年发现仙 台病毒在体内和 体外均引起欧利 希氏腹水癌细胞 的融合。1960年 异种哺乳类动物 仙台病毒图 细胞融合成功 a.套膜上的钉芒具有唾液酸苍酶和血球凝集活动 b.自细胞得来的病毒套膜；c.糖蛋白；d.染色体 细胞融合是六十年代发展起来的一门技术，属 于细胞工程学的一个分支，为体细胞遗传学的 发展开辟了道路。应用细胞融合技术，可以跨 越杂交的障碍，结合不同种的优良性状
⚫ 细胞融合是六十年代发展起来的一门技术，属 于细胞工程学的一个分支，为体细胞遗传学的 发展开辟了道路。应用细胞融合技术，可以跨 越杂交的障碍，结合不同种的优良性状。 •1957年发现仙 台病毒在体内和 体外均引起欧利 希氏腹水癌细胞 的融合。1960年 异种哺乳类动物 细胞融合成功
细胞核 病毒颗粒 一、融合方法 细胞核 1 灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面 促使细胞融合的制剂称为融合剂 细胞融合剂主要分为病毒与化学 物两大类： 〔2) 细胞膜被病毒颗粒穿通 ● 病毒： 仙台病毒、灭活的疱疹病毒、腮腺 Xo 炎病毒以及新城鸡瘟病毒等，其中仙台 (3) 细胞源连接 病毒最早用于诱导细胞融合，成为早期 细胞融合技术广泛采用的标准融合剂； (4) 细胞核融合，形成杂种细胞
一、融合方法 ⚫ 促使细胞融合的制剂称为融合剂。 细胞融合剂主要分为病毒与化学 物两大类： ⚫ 病毒： 仙台病毒、灭活的疱疹病毒、腮腺 炎病毒以及新城鸡瘟病毒等，其中仙台 病毒最早用于诱导细胞融合，成为早期 细胞融合技术广泛采用的标准融合剂；
化学物： 硝酸钠、聚乙二醇(PEG)、聚醋酸乙烯脂(PVA)、聚乙烯吡 咯酮(PVP)、硫酸多缩葡萄糖、溶血卵磷脂，甘油、油酸盐、 UE. 膜动剂（AZC),磷酸温， 脂质以及三价阳离子载体等。其吊以 PEG应用最广，效果最好。 电融合： 利用电场使细胞排列成串，并紧密接触；再使用电脉冲使细胞接 触部分发生细胞膜融合。 激光融合： 利用激光微束破坏相邻细胞的接触区，从而导致细胞膜的融合。 (诱导鱼类细胞融合，张闻迪)
⚫ 化学物： 硝酸钠、聚乙二醇（PEG）、聚醋酸乙烯脂（PVA）、聚乙烯吡 咯酮（PVP）、硫酸多缩葡萄糖、溶血卵磷脂、甘油、油酸盐、 膜动剂（AZC），磷酸盐，脂质以及二价阳离子载体等。其中以 PEG应用最广，效果最好。 ⚫ 电融合： 利用电场使细胞排列成串，并紧密接触；再使用电脉冲使细胞接 触部分发生细胞膜融合。 ⚫ 激光融合： 利用激光微束破坏相邻细胞的接触区，从而导致细胞膜的融合。 （诱导鱼类细胞融合，张闻迪）
细胞融合过程需经过三 细胞融合装贸 细胞融合仪 个阶段(p156图7-1) 电极 输出+ 数字显示表 原生质体 0 1、点接触两个细胞表 ☐电极 面结合在一起的凝集状态。 其结合力不那么强，而且各 能加电压 个细胞保持完整的球形。 200 100 0 2、面接触 病毒PEG等 -100 使细胞进入面接触状态。在 1.未加压 2.加高频交流 电 此阶段各个细胞呈斜球形， 电极 细胞膜异始发生融合。 原生质体状态 3、融合融合过程进一 电极 步进行，则全部形成球或卵 脂分子 形融合细胞。 质膜状态 腹周 膜虹界表
⚫ 细胞融合过程需经过三 个阶段（p156 图7-1） ⚫ 1、点接触 两个细胞表 面结合在一起的凝集状态。 其结合力不那么强，而且各 个细胞保持完整的球形。 ⚫ 2、面接触 病毒/PEG等 使细胞进入面接触状态。在 此阶段各个细胞呈斜球形， 细胞膜开始发生融合。 ⚫ 3、融合 融合过程进一 步进行，则全部形成球或卵 形融合细胞
二、融合细胞的筛选与鉴定 。荧光标记筛选： 荧光抗体技术+流式细胞仪=快速分选术 ●形态、生化或遗传标记： 区别在形态生化上具有明显特征的细胞（藻类）；利用遗传标记 对筛选出的细胞株做鉴定。 。选择培养基筛选： 利用杂种细胞特有的生化途径，使用选择培养基进行筛选。脾脏 细胞与骨髓瘤细胞融合：DNA合成途径1.糖与氨基酸（叶酸为辅 酶)，2.次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷途径。HAT培养基筛选融合细胞
二、融合细胞的筛选与鉴定 ⚫ 荧光标记筛选： 荧光抗体技术+流式细胞仪=快速分选术 ⚫ 形态、生化或遗传标记： 区别在形态\生化上具有明显特征的细胞（藻类）；利用遗传标记 对筛选出的细胞株做鉴定。 ⚫ 选择培养基筛选： 利用杂种细胞特有的生化途径，使用选择培养基进行筛选。脾脏 细胞与骨髓瘤细胞融合：DNA合成途径1.糖与氨基酸（叶酸为辅 酶），2.次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷途径。HAT培养基筛选融合细胞
三、细胞融合技术的应用 单克 k士太4 Epitopes 抗原可 胞增殖 Isolate plcen cells Hybridize Select 田 胞后代 细胞融 Isolate serum ⊙ 1 Plasma cells Myeloma cells Hybridomas 8用喝 Clones 2 Ab-1 Ab-1 Ab-2 Ab- Ab- Polyclonal antiserum Monoclonal antibodies
三、细胞融合技术的应用 ⚫ 单克隆抗体的生产： 外源蛋白通常会诱导脾脏的B淋巴细胞产生抗体， 抗原可诱导多种B细胞合成不同的抗体。被激活的B细 胞增殖产生可合成抗体的后代，称之为克隆。多种B细 胞后代的细胞群，称之为多克隆。单克隆的制备需要 细胞融合技术。 1. B淋巴细胞 2. 骨髓瘤细胞
。微生物有种：酵母与有益曲霉菌的杂交育种。（面 包、葡萄酒等) 。植物有种：1972，粉蓝烟草和郎氏烟草原生质体融 合。目前已应用于粮油作物的再生植株上 。基因定位：融合细胞染色体选择性脱落 Human fibroblast Sendai umor ell virus medium Formation of hybrids Heterokaryote Proliferation of hybrids to form colonies 883 Hybrid cell on selective medium Hybrid colony A Colony B Colony C
⚫ 微生物育种：酵母与有益曲霉菌的杂交育种。（面 包、葡萄酒等） ⚫ 植物育种：1972，粉蓝烟草和郎氏烟草原生质体融 合。目前已应用于粮油作物的再生植株上 ⚫ 基因定位：融合细胞染色体选择性脱落
● 动物育种： 1973年童第周使用仙台病毒诱导金鱼囊胚细胞间及金鱼囊胚细胞与欧 利希氏腹水癌细胞间的融合。 1984阎康利用PEG诱导鲫鱼细胞融合，1986年发现二甲亚砜可大大提 高PEG的诱导效果。 1986年日本学者使用PEG诱导细胞融合虹鳟三倍体，后发现高钙高PH 可提高诱导效果。 1986年郑瑞珍等用那-丙内脂灭活的仙台病毒促使金鱼囊胚细胞融合。 做法是：卵子经人工授精，发育至高囊胚，放入4℃冰箱使发育速度延 缓，备用。融合之前用尖头镊子剥去卵膜，将去膜的卵子放入盛有 Holtfreteri液培养m中，然后用发圈把胚盘从卵黄上切割下来，再用移 液管把胚盘转移到细胞分离液，在室温下放置2·3分钟，再用微吸管 吹打，使其分散成弹个的囊胚细胞，用Holtfreter液洗两次，然后挑选 大小较为一致的圆形囊胚细胞，双双放在盛有β-丙内脂灭活的仙合病 毒液的多孔血凝板上或96孔的培养板里。每孔两个细胞，使彼此粘连 在一起。囊胚细胞的融合与体细胞一样，在37°℃，15-20分钟完成篇融合
⚫ 动物育种： ⚫ 1973年 童第周使用仙台病毒诱导金鱼囊胚细胞间及金鱼囊胚细胞与欧 利希氏腹水癌细胞间的融合。 ⚫ 1984 阎康利用PEG诱导鲫鱼细胞融合，1986年发现二甲亚砜可大大提 高PEG的诱导效果。 ⚫ 1986年 日本学者使用PEG诱导细胞融合虹鳟三倍体，后发现高钙高PH 可提高诱导效果。 ⚫ 1986年 郑瑞珍等用β－丙内脂灭活的仙台病毒促使金鱼囊胚细胞融合。 做法是：卵子经人工授精，发育至高囊胚，放入4℃冰箱使发育速度延 缓，备用。融合之前用尖头镊子剥去卵膜，将去膜的卵子放入盛有 Holtfreter液培养皿中，然后用发圈把胚盘从卵黄上切割下来，再用移 液管把胚盘转移到细胞分离液，在室温下放置2－3分钟，再用微吸管 吹打，使其分散成单个的囊胚细胞，用Holtfreter液洗两次，然后挑选 大小较为一致的圆形囊胚细胞，双双放在盛有β－丙内脂灭活的仙台病 毒液的多孔血凝板上或96孔的培养板里。每孔两个细胞，使彼此粘连 在一起。囊胚细胞的融合与体细胞一样，在37℃,15－20分钟完成融合