武汉大学5表观基因组研究方法WuhanUnive一、全基因组甲基化测序二、甲基化DNA免疫共沉淀测序三、染色质免疫共沉淀测序Laboratory of plant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 5、表观基因组研究方法 一、全基因组甲基化测序 二、甲基化DNA免疫共沉淀测序 三、染色质免疫共沉淀测序
武汉大学全基因组甲基化测序Wuhan Universi研究目的与内容：1、构建全基因组甲基化图谱（DNAmethylationprofiling），全面而精确了解全基因组DNA甲基化状态及其高低甲基化位点在基因组不同区域的分布情况。2、多样品间差异性甲基化区域分析全基因组Bisulfite测序（WholeGenomeBisulfiteSequencing，WGBSBisulfite-Seg）：Bisulfite处理能够将基因组中未甲基化的C碱基与甲基化的C碱基区分开来，是表观遗传学研究的经典方法。将重亚硫酸盐处理方法和高通量测序（例如IlluminaHiSeq）技术结合，能够绘制出单碱基分辨率的DNA甲基化图谱，可用于研究物种特定DNA区域甲基化与特定表型的关联；也是研究表观遗传调控的机制的基础Laboratoryofplantmolecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 一、全基因组甲基化测序 研究目的与内容： 1、构建全基因组甲基化图谱（DNA methylation profiling），全面而精确了 解全基因组DNA甲基化状态及其高低甲基化位点在基因组不同区域的分布情况。 2、多样品间差异性甲基化区域分析 全基因组Bisulfite测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing, WGBS； Bisulfite-Seq ）： Bisulfite处理能够将基因组中未甲基化的C碱基与甲基化的 C碱基区分开来，是表观遗传学研究的经典方法。将重亚硫酸盐处理方法和高通量 测序（例如 Illumina HiSeq）技术结合，能够绘制出单碱基分辨率的DNA甲基化图 谱，可用于研究物种特定DNA区域甲基化与特定表型的关联；也是研究表观遗传 调控的机制的基础
武汉大学Wuhan University全基因组甲基化测序实验技术路线基因组DNA全基因组DNA甲基化文库（DNA片段化末端修复、加A连接接头）Bisulfite处理PCR扩增lluminaHiSeg测序数据整体质量评估参考序列比对MC位点覆盖度统计甲基化位点检测A2X比对率统计甲基化水平统计差异甲基化分析A几八测序深度统计DMR相关功能注释全基因组甲基化水平统计八八DMR相关基因富集分析染色体水平甲基化密度分布A不同基因功能元件甲基化分布统计ACpG,CHG,CHH甲基化比例Laboratoryofplantmolecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 基因组DNA 全基因组DNA甲基化文库（DNA片段化末端修复、加A连接 接头 ）Bisulfite处理PCR扩增 Illumina HiSeq测序数据整体质量评估 参考序列比对 C位点覆盖度统计 甲基化位点检测 比对率统计 差异甲基化分析 甲基化水平统计 测序深度统计 DMR相关功能注释 全基因组甲基化水平统计 DMR相关基因富集分析 染色体水平甲基化密度分布 不同基因功能元件甲基化分布统计 CpG,CHG,CHH甲基化比例 全基因组甲基化测序实验技术路线
武汉大学DNANEBNextP5PrimerAdaptorUracilP7PrimerWuhan UniversityBarcode (BC)USEREnzymePCREnrichmentBC P7Fragmented DNA Input535'653433'55P7BCEnd Repair,5-Phosphorylation and dA-Tailing353inn535'35mi5in3'5P53P5A3A甲基化修饰接头A3A+亚硫酸盐处理：2i0UUUUoininm1noUUUUClean UpLaboratory of plant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 甲基化修饰接头 A A A A U U U U U U U U 亚硫酸盐处理
武汉大学Wuhan University测序样品要求：样品纯度：0D260/280值在1.8-~2.0之间：RNA应去除干净样品浓度：最低浓度不低于50ng/ul样品总量：每个样品总量不少于15ng样品溶剂：应溶解在H,0或TE（pH8.0）中样品运输：DNA低温运输（-20℃）；用parafilm将管口密封好，以防出现污染测序数据质量控制：包括reads数、总base数，Q2o比例Q20位点分布图、碱基分布图测序数据预处理：包括去除总体质量偏低的reads，将质量大于20碱基所占比例小于50%的reads去除：去除3”端质量Q低于20的碱基；去除reads中所有的接头序列；去除长度小于20的测序片段(reads)Laboratory of plant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 测序数据质量控制：包括reads数、总base数，Q20比例、 Q20位点分布图、碱基分布图 测序数据预处理：包括去除总体质量偏低的reads，将质量大于 20碱基所占比例小于50%的reads去除；去除3’端质量Q低于20的 碱基；去除reads中所有的接头序列；去除长度小于20的测序片 段（reads） 测序样品要求： 样品纯度：OD 260/280值 在1.8 ～ 2.0之间；RNA应去除干净 样品浓度：最低浓度不低于50ng/ul 样品总量：每个样品总量不少于15ng 样品溶剂：应溶解在H2O或TE（pH8.0）中 样品运输：DNA低温运输（-20℃）； 用parafilm将管口密封好，以防出现污染
武汉大学WuhanUniversityOCpG岛区域、启动子区域及整个基因组的覆盖及不同深度关系25-4950-99519-24≥1001583NocoverageNocoverage≥100-19-1-4-10-24-5-9-25-49≥100710-24~50-9925-4950-99NocoveragepromoterwholegenomeCpGislandLaboratoryofplant molecular cytogenetics
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武汉大学OCPG/CHG/CHH位点漫盖率、测序深度、甲基化比例和染色体分布Wuhan Univ【2】CpG/CHG/CHH位点甲基化比例【1】CpG/CHG/CHH位点测序深度2005-methylationpercentagesite depthdistribution90+8g20+90oranaRouanai90+090+00'990+0200+0000+90'0?30500102040608010002040reads number【4】高甲基化位点（甲基化比例>70%）和低甲基化位点【3】CpG/CHG/CHH位点染色体分布（甲基化比例<30%）的基因功能区分布chromosomedistribution【5】申基化程度（%）对于基因的不同功能区域的分布25000002000000aH1mCHH/CHH-H1mCHG/CHGH1mCG/CG1001500000eeon8060100000040500000203'UTRIntronPromoter5'UTRExon234567890123456789X卡#####号Laboratory of pla
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武汉大学O差异甲基化位点或区段的CpG岛注释和基因注释0全基因组甲基化图谱[1]差异甲基化位点或区段CpG岛分布【2】差异甲基化位点或区段不同基因功能元件分布ChromosomeGraphCpG content and neighborhood contextPieChartofgenericfeaturesBTUTRHypermethylation Hypomethylation Centromere5.94%(1352)38.87%(8040)Island5.83%(1327)Shore口Lhwwhiachr124.97%(5682)国Others2.68%(609).1-chr2-chr3-141chr4a-chr5营37.27%(7710)39.23%(8927)chr621.35%(4857)23.86%(4935)0chr7ochr8-【3】差异甲基化位点或区段染色体分布ai-chr9chr10+ganwauChromosomelocation-chr11HW/ai5 y1 2s+chr12+chv6: 2211Hw2175schr.13-chr7: 1495+chr14dhrd:1006waw*ehe1:-2604+chr15ch9: 487-4eEiges4 chY::23chr 16chr10: :1315-chr17chrX:2131ov1:-1314中chr18oh22:575ch12: 18046chr21:261Aaeuechr19achr13; 662cr20663chr14:721二ahr19:2043chrXchr15;726-18278chrt6:1107eh17:1903wwchrYchr21-Ichr11chr18--dr22che2ehr7ehr17-"h14chr15-ehrschr10aLaboratory of plant molecular cytogenetics
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武汉大学Wuhan University甲基化DNA免疫共沉淀测序二、CancerMatchNormalMeDIP-Seq (Methylated DNACellsBlood CellsImmunoprecipitationSequencing）测序是基于抗体富集原理进行测序的全DNAExtractionSonication基因组甲基化检测技术，采用甲基化DNA免疫共沉淀技术，通过5“-甲基5mC5mC胞嘧啶抗体特异性富集基因组上发生MeDIP甲基化的DNA片段，然后通过高通量测序可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究。High-throughputSequencing利用MeDIP-Seq技术可以快速有效地寻找基因组上的甲基化区域，从Analysis而比较不同细胞、组织或疾病样本间oNormal的DNA甲基化修饰模式的差异CancerAGenomePositionLaboratory of plant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 二、甲基化DNA免疫共沉淀测序 MeDIP-Seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing）测 序是基于抗体富集原理进行测序的全 基因组甲基化检测技术，采用甲基化 DNA免疫共沉淀技术，通过5‘-甲基 胞嘧啶抗体特异性富集基因组上发生 甲基化的DNA片段，然后通过高通量 测序可以在全基因组水平上进行高精 度的CpG密集的高甲基化区域研究。 利用MeDIP-Seq技术可以快速有 效地寻找基因组上的甲基化区域，从 而比较不同细胞、组织或疾病样本间 的DNA甲基化修饰模式的差异
武汉大学Wuhan University技术路线：aRSamplequalificationTA超游波打断样品质检SampleaualificationRepairendsand add sequencing adaptor未端修复，加测序接头变性MBD甲基化DNA富集加入5-mc价体DNA成筹增DNAamplificationinclusterMeDIP集片股和高通最DNA测序DNA sequencingPCRamplification序所将100bp减50bpReadsSizeselection(200-300bp)测序北对至基国组★Librarytest(TAcione,Angilent2100)计序得到的peakQ-PCRqualification定位甲基化位点ClusterprepareandsequencingLaboratory of plant molecular cytogenetics
Laboratory of plant molecular cytogenetics 优势： 精确度高：基因组位点定位精确 性可达± 50bp。 可靠性高：直接对甲基化片段进 行测序和定量，无交叉反应 和背景噪音。 检测范围广：全基因组范围内甲 基化区域研究。 高性价比：经抗体富集高甲基化 区域进行测序，有效降低 测序费用 技术路线：