生物科学专业《生物工程实验指导》2011
生物科学专业 《生物工程实验指导》 2011
实验一烟草叶片愈伤组织诱导和植株再生选自魏群主编.生物工程技术实验指导.北京：高等教育出版社，2002：152-155[实验目的]通过诱导烟草叶片愈伤组织和植株再生，分析生长素和细胞分裂素对烟草叶片离体培养的作用，了解植物组织在离体培养条件下脱分化和再分化的特点：验证植物细胞全能性，探就离体条件下植物细胞形成完整植株的条件。[实验原理]根据Skoog和Miller提出的生长素和细胞分裂素相对浓度调节器官分化的的概念，相对的生长素浓度有利于细胞增殖和不定根的分化，而相对高的细胞分裂素浓度有利于不定高芽的分化。通过改变激素的种类和浓度，有效地调节培养组织的器官分化，已经在许多植物的组织培养中得到证实，甚至在一些低等植物（如葫芦藓）中也得到了证实。[仪器、材料和试剂](一)仪器1.超净工作台2.高压灭菌锅3.光照培养箱(二)材料1.烟草幼苗2.茶乙酸(Napthylaceticacid，NAA)3.苄基氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，BA)4.2，4一二氯苯氧乙酸（2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-D)5.硝酸铵（NH4NO3)6.硝酸钾(KNO3)7氯化钙（CaC12·2H20）8.硫酸镁（MgS04·7H20)9.磷酸二氢钾(KH2P04)10.碘化钾(KI)11.硼酸（H3B03）12.硫酸锰（MnS04·4H20)13.硫酸锌（ZnS04·7H20)14.钼酸钠（NaMo04·2H20)15.氯化钴（COC12·6H20）16.硫酸铜（CuS04·5H20）17.硫酸亚铁(FeS04·7H20)18.乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）19.甘氨酸（Glycine）20.烟酸(Nicotinicacid，VitaminPP)21.盐酸吡哆醇(Pyridoxine—HCl，VitaminB6)22.盐酸硫胺素（Thiamine一HCl，VitaminB1)23.肌醇(Inositol)1
1 实验一 烟草叶片愈伤组织诱导和植株再生 选自魏群主编.生物工程技术实验指导.北京：高等教育出版社，2002:152-155 [实验目的] 通过诱导烟草叶片愈伤组织和植株再生，分析生长素和细胞分裂素对烟草叶片离体培养 的作用，了解植物组织在离体培养条件下脱分化和再分化的特点；验证植物细胞全能性，探 就离体条件下植物细胞形成完整植株的条件。 [实验原理] 根据 Skoog 和 Miller 提出的生长素和细胞分裂素相对浓度调节器官分化的的概念，相对 高 的生长素浓度有利于细胞增殖和不定根的分化，而相对高的细胞分裂素浓度有利于不定 芽的分化。通过改变激素的种类和浓度，有效地调节培养组织的器官分化，已经在许多植物 的组织培养中得到证实，甚至在一些低等植物(如葫芦藓)中也得到了证实。 [仪器、材料和试剂] (一)仪器 1．超净工作台 2．高压灭菌锅 3．光照培养箱 (二)材料 1．烟草幼苗 2．萘乙酸(Napthylacetic acid，NAA) 3．苄基氨基嘌呤(6-Benzylamino purine，BA) 4．2，4—二氯苯氧乙酸(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D) 5．硝酸铵(NH4NO3) 6．硝酸钾(KNO3) 7．氯化钙(CaCl2·2H20) 8．硫酸镁(MgSO4·7H2O) 9．磷酸二氢钾(KH2PO4) 10．碘化钾(KI) 11．硼酸(H3BO3) 12．硫酸锰(MnSO4·4H2O) 13．硫酸锌(ZnSO4·7H2O) 14．钼酸钠(NaMoO4·2H2O) 15．氯化钴(COCl2·6H2O) 16．硫酸铜(CuSO4·5H2O) 17．硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 18．乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA) 19．甘氨酸(Glycine) 20．烟酸(Nicotinic acid，Vitamin PP) 21．盐酸吡哆醇(Pyridoxine—HCl，Vitamin B6) 22．盐酸硫胺素(Thiamine—HCl，Vitamin B1) 23．肌醇(Inositol)
24糖(Sucrose)25.琼脂（Agar)26.氯化汞(HgC12)27.次氯酸钠(Sodiumhypochlorite)28.二乙酸荧光素(Fluoresceindiacetate，FDA)29.伊凡蓝(Evansblue)30.醋酸(Aceticacid)31.甲醇32.磷酸氢氨（(NH4)2HP04)33.酒精(95%的医用酒精，100%的工业酒精）34.三角瓶（50mL）35.棕色瓶（100mL，500mL，1000mL）36.枪形镊子37.塘瓷烧杯（500mL，1000mL)38.玻璃烧杯（100mL)39.培养皿（Φ=9cm)40解剖刀(三)试剂1.MS基本培养基贮液：大量元素/g·L"微量元素/mg·L有机营养/mg·（100mL)铁母液/g·L(10x)(100x)(100x)(100x)KINH4N0316.583Na2EDTA·2H203.73肌醇1.0005KNO0319H3B046202. 78烟酸FeS04·7H2022305CaC12·2H204. 4MnS04·4H20盐酸吡哆醇3. 7860盐酸硫胺素MgS04·7H20ZnS04·7H2020KH2P041. 7NaMo04·2H2025甘氨酸CoC12·6H202.52..5CuS04·5H202. 1 mol /L NaOH3.1mol / LHC14.生长调节剂贮液(1)10mol / L的萘乙酸溶液：称取18.6mg的萘乙酸用少量1mol/LNa0H溶解后，用水稀释并定容至100mL。(2)10~mol/L的6-苄氨基嘌呤溶液：称取22.5mg6一基氨基嘌呤，用少量1mo1/L的HC1溶解后，用水稀释并定容到100mL。5.70%或75%的消毒酒精（用95%的医用酒精配制）[实验步骤]1.培养基的配制(1)将各种贮液按比例混合，配制成MS培养基。(2)分别加入一定浓度的NAA和BA（在10-10mo1/L范围内，由学生自己设计不同浓度的生长调节剂组合）。2
2 24．蔗糖(Sucrose) 25．琼脂(Agar) 26．氯化汞(HgCl2) 27．次氯酸钠(Sodium hypochlorite) 28．二乙酸荧光素(Fluoresceindiacetate，FDA) 29．伊凡蓝(Evan’s blue) 30．醋酸(Acetic acid) 31．甲醇 32．磷酸氢氨((NH4)2HP04) 33．酒精(95％的医用酒精，100％的工业酒精) 34．三角瓶(50mL) 35．棕色瓶(100mL，500mL，1000 mL) 36．枪形镊子 37．搪瓷烧杯(500 mL，1000 mL) 38．玻璃烧杯(100 mL) 39．培养皿(Φ=9cm) 40．解剖刀 (三)试剂 1．MS 基本培养基贮液： 大量元素／g·L -1 (10X) 微量元素／mg·L -1 (100X) 铁母液／g·L -1 (100X) 有机营养／mg·(100 mL)-l (100X) NH4N03 16．5 KI 83 Na2EDTA·2H20 3.73 肌醇 1 000 KNO3 19 H3B04 620 FeSO4·7H2O 2．78 烟酸 5 CaCl2·2H2O 4．4 MnSO4·4H20 2 230 盐酸吡哆醇 5 MgSO4·7H20 3．7 ZnS04·7H20 860 盐酸硫胺素 1 KH2PO4 1．7 NaMo04·2H20 25 甘氨酸 20 CoCl2·6H20 2．5 CuS04·5H20 2．5 2．1 mol／L NaOH 3．1 mol／L HCl 4．生长调节剂贮液 (1)10-3 mol／L 的萘乙酸溶液： 称取 18．6 mg 的萘乙酸用少量 1 mol／L NaOH 溶解后，用水稀释并定容至 100mL。 (2)10-3 mol／L 的 6-苄氨基嘌呤溶液： 称取22．5mg 6—苄基氨基嘌呤，用少量 1 mol／L 的HCl 溶解后，用水稀释并定容到 100mL。 5．70％或 75％的消毒酒精(用 95％的医用酒精配制) [实验步骤] 1．培养基的配制 (1)将各种贮液按比例混合，配制成 MS 培养基。 (2)分别加入一定浓度的 NAA 和 BA(在 10-6 -10-7 mol／L 范围内，由学生自己设计不同浓度 的生长调节剂组合)
(3)培养基中加入3%蔗糖，0.7%琼脂。加去离子水到一定体积。(4)用1N的NaOH调pH至5.8。（5）将培养基煮沸，分装到50mL三角瓶中。每瓶15一20mL左右。用封口膜或棉塞包扎瓶口。(6)将三角瓶放入高压灭菌锅，在120~c、120000Pa下灭菌15min。待温度降低到105℃以下，打开放气阀排气后，取出三角瓶、平放冷却备用。（7）按上述方法高压灭菌去离子水，烧杯，培养血和相关用具。2.外植体的表面消毒与接种培养(1)取自烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。(2)在超净工作台（操作前开机20min）上将叶片浸于70%酒精的无菌玻璃烧杯中30s，然后移入10%的次氯酸钠溶液中5-10min（消除外植体表面的微生物）。无菌水至少洗涤3次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗于净），每次停留3一5min。(3）将灭菌后的叶片置于无菌培养皿内，用解剖刀将无菌叶片切成5mmX5mm大小。(4)将适宜大小的外植体接种到培养基上，每个三角瓶中接人4一5块叶外植体。(5)将三角瓶置于生长箱或培养室内的培养架上。培养条件为：温度25-27℃，光周期为：光照16h和黑暗8h，光照强度约15001x左右。[实验结果]观察烟草叶外植体的器官分化，如图实验16一1所示。分化的芽叶片愈伤组织照片图示意图图实验16-1烟草叶外植体的器官分化[实验安排]整个实验在1d内完成，学生配制全部试剂和完成全部操作，利用课余时间来培养室观察记录烟草叶片愈伤组织生长、不定芽和不定根分化的情况。3
3 (3)培养基中加入 3％蔗糖，0．7％琼脂。加去离子水到一定体积。 (4)用 1N 的 NaOH 调 pH 至 5．8。 (5)将培养基煮沸，分装到 50mL 三角瓶中。每瓶 15—20 mL 左右。用封口膜或棉塞包扎 瓶口。 (6)将三角瓶放入高压灭菌锅，在 120~C、120 000Pa 下灭菌 15min。待温度降低到 105℃ 以下，打开放气阀排气后，取出三角瓶、平放冷却备用。 (7)按上述方法高压灭菌去离子水，烧杯，培养皿和相关用具。 2．外植体的表面消毒与接种培养 (1)取自烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。 (2)在超净工作台(操作前开机 20min)上将叶片浸于 70％酒精的无菌玻璃烧杯中 30s，然 后移入 10％的次氯酸钠溶液中 5-10 min(消除外植体表面的微生物)。无菌水至少洗涤 3 次(消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净)，每次停留 3—5 min。 (3)将灭菌后的叶片置于无菌培养皿内，用解剖刀将无菌叶片切成 5mmX 5 mm 大小。 (4)将适宜大小的外植体接种到培养基上，每个三角瓶中接人 4—5 块叶外植体。 (5)将三角瓶置于生长箱或培养室内的培养架上。培养条件为：温度 25-27℃，光周期为： 光照 16h 和黑暗 8 h，光照强度约 1 5001x 左右。 [实验结果] 观察烟草叶外植体的器官分化，如图实验 16—1 所示。 [实验安排] 整个实验在 1 d 内完成，学生配制全部试剂和完成全部操作，利用课余时间来培养 室观察记录烟草叶片愈伤组织生长、不定芽和不定根分化的情况
实验二烟草原生质体分离和体细胞杂交选自魏群主编.生物工程技术实验指导.北京：高等教育出版社，2002:156-160[实验目的]通过烟草叶片和愈伤组织原生质体的分离和融合，学习植物原生质体分离和体细胞杂交的一般方法，认识体细胞杂交打破物种生殖隔离，促进种质交流的特点，建立起细胞工程育种技术体系。[实验原理]原生质体是消除细胞壁的细胞部分。利用纤维素酶和果胶酶消化植物细胞壁，能获得大量的原生质体。聚乙二醇(PEG)高钙高pH融合诱导方法是体细胞杂交的主要方法之一。PEG带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。当PEG分子链足够大时，在邻近原生质体表面之间起着分子桥的作用，引起原生质体紧紧粘连成团。Ca2+在蛋白质或磷脂负电荷基团和PEG之间形成桥梁，加强原生质体之间的粘连作用，10mmol/LCaCI2·2H：0能完全消除烟草原生质体表面的电荷。在洗涤过程中，直接或间接与质膜结合的PEG分子从原生质体表面洗脱，并随着pH的降低，导致膜电荷的不平衡和发生重新分布。质膜紧密接触区域的电荷重新分布使一原生质体的某些正电荷基团与另一原生质体的负电荷基团联结，反之亦然，最后导致原生质体发生融合。融合细胞在培养过程中再生细胞壁、分裂生长形成愈伤组织和再生植株，产生体细胞杂种植株。根据双亲遗传物质在体细胞杂种中的遗传，体细胞杂种又分为核对称杂种、核不对称杂种和细胞质杂种。本实验用于诱导核对称杂种。[仪器、材料和试剂](一)仪器1．超净工作台2.高压灭菌锅3.光照培养箱4.低速离心机5.倒置光学显微镜(二)材料1.烟草试管苗叶片和愈伤组织2.萘乙酸(Napthylaceticacid·，NAA)3.芊基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，BA)4.2，4一二氯苯氧乙酸(2，4一Dichlorophenoxyaceticacid，2，4—D）5.硝酸铵(NH，NO，）6.硝酸钾(KNO，）7.氯化钙(CaCI2·2H2O)8.硫酸镁(MgSO4·7H209.磷酸二氢钾(KH2P04)10.碘化钾(KI)11.硼酸(H3B03)12.硫酸锰(MnS04·4H20)13.硫酸锌(ZnS04·7H20)4
4 实验二 烟草原生质体分离和体细胞杂交 选自魏群主编.生物工程技术实验指导.北京：高等教育出版社，2002:156-160 [实验目的] 通过烟草叶片和愈伤组织原生质体的分离和融合，学习植物原生质体分离和体细胞杂交 的一般方法，认识体细胞杂交打破物种生殖隔离，促进种质交流的特点，建立起细胞工程育 种技术体系。 [实验原理] 原生质体是消除细胞壁的细胞部分。利用纤维素酶和果胶酶消化植物细胞壁，能获得大 量的原生质体。聚乙二醇(PEG)高钙高 pH 融合诱导方法是体细胞杂交的主要方法之一。PEG 带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。当 PEG 分子链足够大时，在邻近原生质体表面之间起着分子桥的作用，引起原生质体紧紧粘连 成团。Ca2+在蛋白质或磷脂负电荷基团和 PEG 之间形成桥梁，加强原生质体之间的粘连作 用，10mmol／LCaCl2·2H：0 能完全消除烟草原生质体表面的电荷。在洗涤过程中，直接或 间接与质膜结合的 PEG 分子从原生质体表面洗脱，并随着 pH 的降低，导致膜电荷的不平衡 和发生重新分布。质膜紧密接触区域的电荷重新分布使一原生质体的某些正电荷基团与另一 原生质体的负电荷基团联结，反之亦然，最后导致原生质体发生融合。融合细胞在培养过程 中再生细胞壁、分裂生长形成愈伤组织和再生植株，产生体细胞杂种植株。根据双亲遗传物 质在体细胞杂种中的遗传，体细胞杂种又分为核对称杂种、核不对称杂种和细胞质杂种。本 实验用于诱导核对称杂种。 [仪器、材料和试剂] (一)仪器 1．超净工作台 2．高压灭菌锅 3．光照培养箱 4．低速离心机 5．倒置光学显微镜 (二)材料 1．烟草试管苗叶片和愈伤组织 2．萘乙酸(Napthylacetic acid·，NAA) 3．苄基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，BA) 4．2，4—二氯苯氧乙酸(2，4—Dichlorophenoxyacetic acid，2，4—D) 5．硝酸铵(NH，NO，) 6．硝酸钾(KNO，) 7．氯化钙(CaCl2·2H2O) 8．硫酸镁(MgSO4·7H2O 9．磷酸二氢钾(KH2P04) 10．碘化钾(K1) 11．硼酸(H3B03) 12．硫酸锰(MnS04·4H20) 13．硫酸锌(ZnS04·7H20)
14.钼酸钠(NaM004·2H20)15.氯化钻，（CoCI2·6H20)16.硫酸铜（CuS04·5H20)17.硫酸亚铁(FeS04·7H20)18.乙二胺四乙酸二钠（NaaEDTA）19.甘氨酸(Glycine)20.烟酸(Nicotinicacid，VitaminPP)21.盐酸吡哆醇(Pyridoxine·HCl，VitaminB22.盐酸硫胺素(Thiamine一HCI，VitaminB1)23.肌醇(Inosito1)24.煎糖(Sucrose)25.琼脂(Agar)26.氯化汞(HgCI2)27.次氯酸钠(Sodiumhypochlorite)28.二乙酸荧光素(Fluoresceindiacetate，FDA)29.伊凡蓝(Evansblue)30.醋酸(HAc)31.甲醇32.磷酸氢氨(NH4)2HP04)33.酒精(95%的卫生酒精，100%的工业酒精）34.三角瓶(50mL)35.枪形镊子36.血细胞计数板37.葡萄糖38.氢氧化钠(NaOH)39.盐酸(HCI)40.纤维素酶OnozukaR—10(CellulaseOnozukaR—10)41.7离析酶R-10(MacerozymeR-10)42.二甲基亚(DMSO)43.甘露醇44.氯化钠(NaCI)45.氯化钾(KCI)46.细菌过滤器(0.45pm的硝酸纤维素膜）47.培养皿(直径4.5cm)48.解剖刀49.尼龙网筛或不锈钢网筛(300目）(三)试剂1.D2原生质体培养基(1)大量元素(mg/L）NH4N03270KN031480CaCI2，2H20900900MgS04-7H20170KH2P045
5 14．钼酸钠(NaM004·2H20) 15．氯化钻，(CoCl2·6H20) 16．硫酸铜(CuS04·5H20) 17．硫酸亚铁(FeS04·7H20) 18．乙二胺四乙酸二钠(NaaEDTA) 19．甘氨酸(Glycine) 20．烟酸(Nicotinic acid，Vitamin PP) 21．盐酸吡哆醇(Pyridoxine·HCl，Vitamin B‘) 22．盐酸硫胺素(Thiamine—HCl，Vitamin B1) 23．肌醇(1nosit01) 24．蔗糖(Sucrose) 25．琼脂(Agar) 26．氯化汞(HgCl2) 27．次氯酸钠(Sodiumhypochlorite) 28．二乙酸荧光素(Fluoresceindiacetate，FDA) 29．伊凡蓝(Evan’sblue) 30．醋酸(HAc) 31．甲醇 32．磷酸氢氨((NH4)2HP04) 33．酒精(95％的卫生酒精，100％的工业酒精) 34．三角瓶(50mL) 35．枪形镊子 36．血细胞计数板 ， 37．葡萄糖 38．氢氧化钠(NaOH) 39．盐酸(HCl) 40．纤维素酶 OnozukaR—10(CellulaseOnozukaR—10) 41．离析酶 R—10(Macerozyme R—10) 42．二甲基亚砜(DMSO) 43．甘露醇 44．氯化钠(NaCl) 45．氯化钾(KCl) 46．细菌过滤器(0．45 pm 的硝酸纤维素膜) 47．培养皿(直径 4．5 cm) 48．解剖刀 49．尼龙网筛或不锈钢网筛(300 目) (三)试剂 1．D2 原生质体培养基 (1)大量元素(mg／L) NH4N03 270 KN03 1 480 CaCl2，2H20 900 MgS04·7H20 900 KH2P04 170
(2)碳素营养葡萄糖0.4mol / L煎糖0.05mol / L(3)生长调节剂NAA 0. 5-1. 0mg / LBA0.050.1mg/L(4)D2原生质体培养基的其他成分同MS基本培养基(见附录）2.MS分化培养基MS基本培养基+0.2mg/LBA+0.01mg/LNAA+3%蔗糖+0.6%琼脂3.原生质体分离的酶液组成(1)CPW培养基(mg/L)，pH5.4KH2P0427. 2KN03101CaCI2-2H201480246MgS04-7H20K10.16.CuS04·5H200.025(2)2%纤维素酶OnozukaR一10，0.5%离析酶R一10(3)0.4mol / L甘露醇4。PEG融合液(1)20%PEG600，0.06mol/LCaCI2，0.3mol/L甘露醇(2)1mol /L甘氨酸一NaOH，pH10.0(3)二甲基亚矾(DMSO)(4)使用前将(1)，(2)和(3)溶液按8：1：1比例混合5，Ws稀释液(pH5.6)125mmol/LCaCI2，155mmol/LNaCl，5mmol/LKCl，5mmol/L葡萄糖[实验步骤]1.原生质体分离(1)用0.45um孔径硝酸纤维素膜的细菌过滤器过滤酶液和液体D2原生质体培养基。(2)分别取试管苗幼叶和2一3周龄的愈伤组织，用解剖刀切成小块，按材料：酶液二1：10加入无菌酶液，在25℃黑暗条件下消化细胞壁4一6h，间歇轻轻摇动（植物原生质体非常容易破碎，各种操作必需小心)。2．原生质体的纯化（在超净工作台上用300目孔径的尼龙网筛过滤原生质体到10mL有盖离心管内（过滤液中含原生质体和细胞碎片)。(2)806一1000r/rain离心3一5min，用无菌吸管吸弃酶液。沿离心管管壁缓缓加入无酶类的原生质体分离液，轻轻吸打原生质体沉淀，重新悬浮原生质体，800一1000r/rain离心3-5rain（离心速度大或时间长，均使原生质体沉淀紧密，重新悬浮吸打时容易导致原生质体破裂。重复2次。(3)原生质体重新悬浮在少量的CPW培养基(含0.4mol/L甘露醇)中。用血球计数板在显微镜下计数和统计原生质体密度，用同样的CPW培养基调整原生质体密度到1X106/mL。3.原生质体融合(1)将叶肉原生质体和愈伤组织原生质体等体积混合，取0.2mL原生质体混合悬浮液6
6 (2)碳素营养 葡萄糖 0．4mol／L 蔗糖 0．05 mol／L (3)生长调节剂 NAA 0．5—1．0 mg／L BA 0．05—0．1 mg／L (4)D2 原生质体培养基的其他成分同 MS 基本培养基(见附录) 2．MS 分化培养基 、 MS 基本培养基+0．2mg／LBA+0．01 mg／LNAA+3％蔗糖+0．6％琼脂 3．原生质体分离的酶液组成 (1)CPW 培养基(mg／L)，pH 5．4 KH2P04 27．2 KN03 101 CaCl2·2H20 1 480 MgS04·7H20 246 K1 0．16 ． CuS04·5H20 0．025 (2)2％纤维素酶 OnozukaR—10，0．5％离析酶 R—10 (3)0．4mol／L 甘露醇 4。PEG 融合液 (1)20％PEG600，0．06mol／LCaCl2，0．3 mol／L 甘露醇 (2)1 mol／L 甘氨酸—NaOH，pH 10．0 (3)二甲基亚砜(DMSO) (4)使用前将(1)，(2)和(3)溶液按 8：1：1 比例混合 5，Ws 稀释液(pH 5．6) 125 mmol／LCaCl2，155 mmol／LNaCl，5 mmol／LKCl，5 mmol／L 葡萄糖 [实验步骤] 1．原生质体分离 (1)用 0．45um 孔径硝酸纤维素膜的细菌过滤器过滤酶液和液体 D2 原生质体培养基。 (2)分别取试管苗幼叶和 2—3 周龄的愈伤组织，用解剖刀切成小块，按材料：酶液二 1： 10 加入无菌酶液，在 25℃黑暗条件下消化细胞壁 4—6 h，间歇轻轻摇动(植物原生质体非常 容易破碎，各种操作必需小心)。 2．原生质体的纯化 (在超净工作台上用 300 目孔径的尼龙网筛过滤原生质体到 10 mL 有盖离心管内(过滤 液中含原生质体和细胞碎片)。 (2)806—1 000r／rain 离心 3—5 min，用无菌吸管吸弃酶液。沿离心管管壁缓缓加入无 酶类的原生质体分离液，轻轻吸打原生质体沉淀，重新悬浮原生质体，800—1 000 r／rain 离 心 3-5 rain(离心速度大或时间长，均使原生质体沉淀紧密，重新悬浮吸打时容易导致原生质 体破裂)。重复 2 次。 (3)原生质体重新悬浮在少量的 CPW 培养基(含 0．4mol／L 甘露醇)中。用血球计数板 在显微镜下计数和统计原生质体密度，用同样的 CPW 培养基调整原生质体密度到 1X106／ mL。 3．原生质体融合 (1)将叶肉原生质体和愈伤组织原生质体等体积混合，取 0．2mL 原生质体混合悬浮液
到另一支无菌离心管中。(2)将(1)，(2)和(3)溶液按8：1：1比例混合后，沿离心管管壁缓慢加入0.2mL新混合的PEG融合液，静置10min（原生质体紧密地粘连在一起）。(3)在5rain内慢慢地加入5mLW5稀释液：静置1h(原生质体在稀释液的处理下，逐渐发生融合，此时切忌振动)。(4)800—100fr/rain离心3—5rain，原生质体重新悬浮在稀释液中，静置30rain，(5)用原生质体培养液离心纯化2次，最后调整原生质体密度到105/mL。4.融合细胞的观测取一滴融合处理后的原生质体悬浮液于载玻片上或培养皿中，在倒置显微镜下观察。叶肉原生质体密布叶绿体，愈伤组织原生质体的细胞质透明，融合的原生质体中存在部分叶绿体(图实验17—1)。5.原生质体培养(1)1mL原生质体悬浮液植板于直径为4.5cm的培养皿中，用parafilm封口（新培养：的原生质体呈圆形)，置于25《C、3001x条件下培养(光照强，抑制原生质体生长)。(2)培养2d后，原生质体为椭圆形，表明细胞壁再生。培养3一5d后，再生细胞发生：第十次分裂。培养条件将光照提高到15001x。(3)培养2周后，加入0.5mL糖浓度减半的原生质体培养基(培养基中渗透剂浓度高时，抑制再生细胞的分裂和生长)。(4)培养4周后，将愈伤组织转移到MS再生培养基上，诱导植株再生。进一步对再生植株进行遗传分析，鉴定体细胞杂种植株。[实验结果]叶绿体8E示意图照片图观察原生质体融合产物（图实验17—1[实验安排]第一天：配制全部试剂。第二天：原生质体分离，纯化，融合和培养。显微观察原生质体融合产物。准备烟草试管苗和愈伤组织。第三天：配制MS分化培养基。将愈伤组织转移到MS再生培养基上，诱导植株再生。学生利用课余时间观察原生质体再生细胞分裂和生长，更换新鲜、低渗透剂浓度的培养基。7
7 到另一支无菌离心管中。 (2)将(1)，(2)和(3)溶液按 8：1：1 比例混合后，沿离心管管壁缓慢加入 0．2mL 新混合 的 PEG 融合液，静置 10min(原生质体紧密地粘连在一起)。 (3)在 5 rain 内慢慢地加入 5 mLW5 稀释液：静置 1 h(原生质体在稀释液的处理下，逐渐 发生融合，此时切忌振动)。 (4)800—1 00ffr／rain 离心 3—5 rain，原生质体重新悬浮在稀释液中，静置 30rain。 (5)用原生质体培养液离心纯化 2 次，最后调整原生质体密度到 105／mL。 4．融合细胞的观测 取一滴融合处理后的原生质体悬浮液于载玻片上或培养皿中，在倒置显微镜下观察。叶 肉原生质体密布叶绿体，愈伤组织原生质体的细胞质透明，融合的原生质体中存在部分叶绿 体(图实验 17—1)。 5．原生质体培养 (1)1 mL 原生质体悬浮液植板于直径为 4．5cm 的培养皿中，用 parafilm 封口(新培养： 的原生质体呈圆形)，置于 25《C、3001x 条件下培养(光照强，抑制原生质体生长)。 (2)培养 2d 后，原生质体为椭圆形，表明细胞壁再生。培养 3—5d 后，再生细胞发生： 第十次分裂。培养条件将光照提高到 1 5001x。 (3)培养 2 周后，加入 0．5mL 糖浓度减半的原生质体培养基(培养基中渗透剂浓度高时， 抑制再生细胞的分裂和生长)。 (4)培养 4 周后，将愈伤组织转移到 MS 再生培养基上，诱导植株再生。进一步对再生 植株进行遗传分析，鉴定体细胞杂种植株。 [实验结果] 观察原生质体融合产物(图实验 17—1) [实验安排] 第一天：配制全部试剂。 第二天：原生质体分离，纯化，融合和培养。显微观察原生质体融合产物。准备烟草试 管苗和愈伤组织。 第三天：配制 MS 分化培养基。将愈伤组织转移到 MS 再生培养基上，诱导植株再生。 学生利用课余时间观察原生质体再生细胞分裂和生长，更换新鲜、低渗透剂浓度的 培养基
实验三烟草叶盘法转基因一实验目的：学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。二.实验原理：土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。农杆菌中有一种环形的Ti质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养2-4天，而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后，再生出完整的植株。三。试剂及设备1.试剂及用品：MS培养基：配方见"植物的组织培养技术”实验指导Kan：卡那霉素Cef:头孢噻钠NAA：萘乙酸6-BA：细胞分裂素Rif:利福平Beefextract（牛肉浸膏）Yeast extract（酵母膏）Peptone（蛋白陈）Sucrose（煎糖）MgS04-7H20（硫酸镁）Hyg潮霉素保鲜膜滤纸培养Ⅲ
8 实验三 烟草叶盘法转基因 一.实验目的： 学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。 二. 实验原理： 土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。农杆菌中有一种环 形的 Ti 质粒，Ti 质粒最重要的两个区域为 T-DNA 区和毒性区，T-DNA 是 Ti 质粒上唯一能够 整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助 T-DNA 区整合到植物的染色体上。 土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。这种转基因方法十分简单，一般是将植物 的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养 2-4 天，而后转移到加有选择压的分化培养基 上分化出芽，在 MS 培养基上生根后，再生出完整的植株。 三. 试剂及设备 1.试剂及用品： MS 培养基：配方见“植物的组织培养技术”实验指导 Kan：卡那霉素 Cef：头孢噻肟钠 NAA：萘乙酸 6-BA：细胞分裂素 Rif: 利福平 Beef extract（牛肉浸膏） Yeast extract（酵母膏） Peptone（蛋白胨） Sucrose（蔗糖） MgSO4·7H2O（硫酸镁） Hyg：潮霉素 保鲜膜 滤纸 培养皿
封口膜T1培养基：MS培养基T2培养基：MS培养基+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Hyg20mg/L+Cb500mg/LT3培养基：MS培养基+Hyg15mg/L+Cb500mg/L（T2：生长培养基：T3：生根培养基）2.仪器：光照培养箱，恒温摇床，超净工作台，接种器械等四.实验步骤：1农杆菌培养1）从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3mlYEB液体培养基中（Str25μg/ml、Rif50μg/ml、Kan80μg/ml）于恒温摇床上27℃，180rpm摇培过夜至OD600为0.6-0.8。2）摇培过夜的菌液按1%-2%的比例，转入新配置的无抗生素的YEB培养基中，在与上述相同的条件下培养6h左右，OD600为0.2-0.5时即可用于转化。或：将按上述方法培养的OD600为0.6-0.8的菌液，转入无菌离心管中，于室温条件下，5000rpm离心10min，去掉上清液，菌体用1/2MS液体（pH5.4-5.8）培养基重悬，稀释至OD600为0.2左右，用于转化。2侵染于超净工作台上，将菌液倒入无菌的小培养皿中。取不具Kan抗性的烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成0.5cm2的小块，放入菌液中，浸泡适当时间（一般5-10min）。取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。：同时设未经农杆菌侵染的叶盘作为阴性对照，以下步骤同。3共培养将侵染后的烟草叶片接种在不含任何激素和抗生素的MS基本培养基（T1）上，用封口膜封好培养皿，28℃黑暗中培养2-4天。4选择培养将黑暗中共培养2-4天的烟草叶片转移到筛选培养基（T2)中，用封口膜封好培养皿，在光照为2.000-10000lux、25-28℃、16/8hd-1光暗条件下选择培养。：叶盘边缘轻压入培养基中，以增加选择压力。5生根培养9
9 封口膜 T1 培养基：MS 培养基 T2 培养基：MS 培养基+6-BA1.0mg/L+NAA0.1 mg/L+Hyg20 mg/L+Cb500 mg/L T3 培养基：MS 培养基+ Hyg15 mg/L+Cb500 mg/L （T2：生长培养基；T3：生根培养基） 2.仪器： 光照培养箱，恒温摇床，超净工作台，接种器械等 四.实验步骤： 1 农杆菌培养 1） 从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到 3 ml YEB 液体培养基中（Str 25 μg/ml、Rif 50 μg/ml、Kan 80 μg/ml）于恒温摇床上 27℃，180 rpm 摇培过夜至 OD 600 为 0.6-0.8。 2） 摇培过夜的菌液按 1%-2%的比例，转入新配置的无抗生素的 YEB 培养基中， 在与上述相同的条件下培养 6 h 左右，OD600 为 0.2-0.5 时即可用于转化。 或： 将按上述方法培养的 OD 600 为 0.6-0.8 的菌液，转入无菌离心管中，于室温 条件下，5000 rpm 离心 10 min，去掉上清液，菌体用 1/2 MS 液体（pH 5.4-5.8）培养基 重悬，稀释至 OD600 为 0.2 左右，用于转化。 2 侵染 于超净工作台上，将菌液倒入无菌的小培养皿中。取不具 Kan 抗性的烟草无菌苗的 幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成 0.5 cm2 的小块，放入菌液中，浸泡适当时间（一 般 5-10 min）。取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。 ：同时设未经农杆菌侵染的叶盘作为阴性对照，以下步骤同。 3 共培养 将侵染后的烟草叶片接种在不含任何激素和抗生素的 MS 基本培养基（T1）上，用封 口膜封好培养皿，28℃ 黑暗中培养 2-4 天。 4 选择培养 将黑暗中共培养 2-4 天的烟草叶片转移到筛选培养基(T2)中，用封口膜封好培养皿， 在光照为 2,000-10,000 lux、25-28℃、16/8 hd-1 光暗条件下选择培养。 ：叶盘边缘轻压入培养基中，以增加选择压力。 5 生根培养