野生动物研究法-课程教学改革与实践实验室操作技术指导2011
1 野生动物研究法-课程教学改革与实践 实验室操作技术指导 2011
目录实验一动物DNA的提取T实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA.实验三SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外源蛋白的表达10实验四PCR体外扩增DNA片段与扩增产物的检测分析错误！未定义书签。实验五从琼脂糖凝胶中回收DNA片断错误！未定义书签。实验六目的基因片段与载体连接错误！未定义书签。实验七RAPD和ISSR技术.20实验八SSR简单序列重复标记22实验九PCR单链构象多态性分析错误！未定义书签。24实验十DNA指纹图谱分析实验十一动物总RNA的提取及含量测定27实验十二动物组织mRNA提取实验方法34实验十三 RNA的定量和完整性分析35实验十四综合实验：逆转录PCR.38附录：常用缓冲液的配置41C
2 目录 实验一 动物DNA的提取 . 3 实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA. 8 实验三 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外源蛋白的表达. 10 实验四 PCR体外扩增DNA片段与扩增产物的检测分析 . 错误！未定义书签。 实验五 从琼脂糖凝胶中回收DNA片断. 错误！未定义书签。 实验六 目的基因片段与载体连接. 错误！未定义书签。 实验七 RAPD和ISSR技术. 20 实验八 SSR简单序列重复标记 . 22 实验九 PCR 单链构象多态性分析. 错误！未定义书签。 实验十 DNA指纹图谱分析. 24 实验十一 动物总 RNA 的提取及含量测定 . 27 实验十二 动物组织mRNA提取实验方法.34 实验十三 RNA的定量和完整性分析.35 实验十四 综合实验：逆转录 PCR .38 附录：常用缓冲液的配置.41
实验一动物DNA的提取新鲜组织DNA的提取一、1.实验原理生物组织中的DNA是以核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中，提取前首先应粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，使DNP释放出来，再用苯酚提取蛋白。由于细胞中的核糖核蛋白(RNP）和DNP往往一起被提取，DNA沉淀中混有RNA。需用核糖核酸酶(RNase)处理，去除RNA。并用蛋白酶将遗留的少量蛋白质水解除去，再经苯酚处理，乙醇沉淀，最后可得较为纯净的DNA。它的纯度可以从260nm波长处的光密度和280nm波长处的光密度之比值测知，一般以O.D260nm/O.D280nm能达到1.8左右为标准。DNA的定量可采用化学的定磷法、定核酸法。目前多数实验室采用紫外分光光度法测定核酸含量，以下公式可作为紫外定量时参考：双链DNA含量：O.D260nmX样品稀释倍数×50ug/ml=ug/ml样品。2.试剂及器材1）：塑料离心管：62）：刻度离心管：13）.滴管：长：1吸酚：氯仿混合液中：1吸乙醇短(钝口)1吸DNA水溶液4）：细玻棒：15）：移液管：16）：微量取样器17）：手套：1副8）．离心机9）：紫外分光光度计10）：37℃水浴，50℃水浴11）：组织捣碎器12）：电泳仪及电泳槽13），裂解缓冲液：50mmol /1Tris—Hcl pH7.420mmol/IEDTA0.5%SDS100mmol/lNaCI（1mol/lTris-HCI pH7.450ml，20%SDS25ml,2mol/lNaCl50ml，0.5mol/lEDTA40ml，蒸馏水稀释至1000ml）其中Tris-HclpH7.4维持PH恒定，防止DNA变性和水解。EDTA能络合二价金属离子，当Mg+，被络合后，细胞内释放出来的DNA酶的作用被抑制，以避免DNA的降解，同时金属离于络合后，细胞膜的稳定性下降，有利于膜的裂解：SDS有使蛋白质变性的作用，它能破坏膜蛋白的构象，因此使膜裂解，它又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离，并且SDS也具有抑制DNA酶的作用。14）．苯酚重蒸苯酚加入抗氧化剂8一羟喹啉1mg/ml，用1mol/lPH8.0Tris-HCl，洗一次，再用0.1mol3
3 实验一 动物 DNA 的提取 一、 新鲜组织DNA 的提取 1. 实验原理 生物组织中的DNA是以核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中，提取前首先应粉碎组织，裂 解细胞膜和核膜，使DNP 释放出来，再用苯酚提取蛋白。由于细胞中的核糖核蛋白(RNP) 和DNP 往往一起被提取，DNA 沉淀中混有RNA。需用核糖核酸酶(RNase)处理，去除RNA。 并用蛋白酶将遗留的少量蛋白质水解除去，再经苯酚处理，乙醇沉淀，最后可得较为纯净的 DNA。它的纯度可以从260nm波长处的光密度和280nm 波长处的光密度之比值测知，一般 以O.D260nm／O.D280nm 能达到1.8 左右为标准。 DNA 的定量可采用化学的定磷法、定核酸法。目前多数实验室采用紫外分光光度法测 定核酸含量，以下公式可作为紫外定量时参考：双链DNA 含量：O.D260nm×样品稀释倍 数×50ug／ml= ug/m1 样品。 2. 试剂及器材 1）．塑料离心管：6 2）．刻度离心管：1 3）. 滴管：长： 1 吸酚：氯仿混合液 中： 1 吸乙醇 短(钝口) 1 吸DNA 水溶液 4）．细玻棒：1 5）．移液管：1 6）．微量取样器1 7）．手套：1 副 8）．离心机 9）．紫外分光光度计 10）．37℃水浴，50℃水浴 11）．组织捣碎器 12）．电泳仪及电泳槽 13）．裂解缓冲液： 50mmol／l Tris—Hcl pH7.4 20mmol/lEDTA、 0.5％SDS 100mmol/l NaCl （1 mol/l Tris-HCl pH7.4 50ml，20％SDS 25ml， 2mol/l NaCl 50ml，0.5mol/l EDTA 40ml，蒸馏水稀释至 1000ml） 其中Tris-Hcl pH7．4 维持PH 恒定，防止DNA 变性和水解。EDTA 能络合二价金属离 子，当Mg+’被络合后，细胞内释放出来的DNA 酶的作用被抑制，以避免DNA 的降解， 同时金属离于络合后，细胞膜的稳定性下降，有利于膜的裂解；SDS 有使蛋白质变性的作 用，它能破坏膜蛋白的构象，因此使膜裂解，它又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离，并且 SDS 也具有抑制DNA 酶的作用。 14）．苯酚 重蒸苯酚加入抗氧化剂8—羟喹啉1mg／ml，用1mol/l PH8．0 Tris-HCl，洗一次，再用0.1mol
/1Tris-HCIPH8.0，洗二次，苯酚PH在7.6-7.8之间。15）：苯酚：氯仿混和液（1：1)苯酚加上等体积氯仿并用水饱和，混和液分层，上层为水相，下层为有机相且带黄色。苯酚和气仿都是蛋白质变性剂，苯酚使蛋白质变性的作用强于氯仿，但氯仿具有较好的分层作用。16）：无水乙醇DNA在PH7.4条件下分于带负电，在NaCI存在条件下，DNA盐呈电中性，乙醇将DNA分子周围的水分夺去，DNA失水形成白色絮状沉淀。17）：TE缓冲液50mmol/lTris-HCIpH7.05mmol/lEDTA：（Imol/ITris-HCIpH7.410ml，0.5mol/lEDTA蒸馏水稀释至1000ml）18）：RNase10mg/ml称取RNase溶解在10mmol/1Tris-HCl(PH7.5)和15mmol/LTris一Hcl(PH7.5)和15mmol/INacl落液中使之浓度为10mg/ml。100℃加温15分钟，使夹杂的少许DNase失活，然后慢慢冷却，分装于小管中—20C保存。19）：蛋白酶K(10mg/ml）一20℃保存。蛋白酶K优点一一水解能力很强，作用广泛，可与SDS及EDTA合并使用。20）：20%SDS21).0.5mol/LEDTA22）：12mol/L高氯酸3.实验步骤1）：取新鲜鼠肝用冰生理盐水洗去血水，用滤纸吸千后，一70C冰箱中保存，用时取出。2）.1克鼠肝加10ml裂解缓冲液，在组织勾浆器中勾浆约1分钟(2次，每次1/2分钟3）：取塑料离心管1支加入1/3支匀浆液（若匀浆液太稠，则再加入ImlITE缓冲液），然后再加入等体积苯酚：氯仿混和液抽提。每次抽提轻缓地来回摇动5分钟，然后离心t0000转/分钟×5分钟，水相吸入另一干净的离心管中，重复抽提二次。注意：每次水相时不要将界面上的变性蛋白质混入，抽提二次后一般有机相和水相界面上的变性蛋白质极少，肉眼基本看不见。若界面上变性蛋白质仍较多，可增加抽提次数。4）：水相加入一刻度离心管中后，加入2.5倍体积的冰无水乙醇（可用刻度离心管测量体积)。加5mol/LNaGI到终浓度为0.1mol/L，在离心管中轻缓的混匀，此时可见白色絮状沉淀，此即DNA粗制品。5）：用玻棒捞起DNA沉淀，放入小烧杯中，用70%乙醇洗涤沉淀一次，洗涤时动作要轻，防止DNA被切断。6）：沉淀取出放入一干净的塑料离心管中，用ImlTE缓冲液溶解。7）：在lmlDNA溶液中加入10mg/ml的RNA酶20μ1，使最终浓度达到200ug/ml，37℃保温30分钟。8）：加入20%SDS25ul，使最终浓度至0.5%加入0.5mol/lEDTA30ul至20mmol/l加10mg/ml蛋白酶K20ul，使最终浓度为200ug/ml，50E保温30分钟。9）：加等体积苯酚：氯仿混合液抽提，重复一次，去除蛋白酶K及其它残留的蛋白质，4
4 ／1 Tris-HCl PH8.0，洗二次，苯酚PH 在7．6-7．8 之间。 15）．苯酚：氯仿混和液(1：1) 苯酚加上等体积氯仿并用水饱和，混和液分层，上层为水相，下层为有机相且带黄色。 苯酚和气仿都是蛋白质变性剂，苯酚使蛋白质变性的作用强于氯仿，伹氯仿具有较好的分层 作用。 16）．无水乙醇 DNA 在PH7．4 条件下分于带负电，在NaCl 存在条件下，DNA 盐呈电中性， 乙醇将DNA 分子周围的水分夺去，DNA 失水形成白色絮状沉淀。 17）．TE 缓冲液 50mmol/l Tris-HCl pH7.0 5mmol/l EDTA （l mol／l Tris-HCl pH7.4 10ml，0．5mol/l EDTA蒸馏水稀释至 1000ml） 18）． RNase 10mg/ml 称取RNase 溶解在10mmol／l Tris-HCl(PH7．5)和 15mmol／L Tris—Hcl(PH7.5)和15mmol／lNacl 落液中使之浓度为10mg／ml。 100℃加温15 分钟，使夹杂的少许DNase 失活，然后慢慢冷却，分装于小管 中—20C 保存。 19）． 蛋白酶K(10mg/m1)—20℃保存。 蛋白酶K 优点——水解能力很强，作用广泛，可与SDS 及EDTA 合并使用。 20）． 20％ SDS 21）． 0．5mol／L EDTA 22）． 12mol／L 高氯酸 3. 实验步骤 1）．取新鲜鼠肝用冰生理盐水洗去血水，用滤纸吸千后，—70C 冰箱中保存，用时取出。 2）. 1克鼠肝加10ml 裂解缓冲液，在组织匀浆器中匀浆约1 分钟(2 次，每次1／2分钟) 3）．取塑料离心管1 支加入1／3 支匀浆液(若匀浆液太稠，则再加入lmlTE 缓冲液)，然后 再加入等体积苯酚：氯仿混和液抽提。每次抽提轻缓地来回摇动5 分钟，然后离心t0000 转 ／分钟×5 分钟，水相吸入另一干净的离心管中，重复抽提二次。 注意：每次水相时不要将界面上的变性蛋白质混入，抽提二次后一般有机相和 水相界面上的变性蛋白质极少，肉眼基本看不见。若界面上变性蛋白质仍较多， 可增加抽提次数。 4）． 水相加入一刻度离心管中后，加入2．5 倍体积的冰无水乙醇(可用刻度离心管测量体 积)。加5mol／LNaGI 到终浓度为0.1mol／L，在离心管中轻缓的混匀，此时可见白色絮状 沉淀，此即DNA 粗制品。 5）． 用玻棒捞起DNA 沉淀，放入小烧杯中，用70％乙醇洗涤沉淀一次，洗涤时动作要轻， 防止DNA 被切断。 6）． 沉淀取出放入一干净的塑料离心管中，用lmlTE 缓冲液溶解。 7）． 在lmlDNA 溶液中加入10mg／ml 的RNA 酶20μl，使最终浓度达到200ug／ml，37℃ 保温30 分钟。 8）． 加入20％SDS25ul，使最终浓度至0．5％；加入0．5mol/l EDTA30ul 至20mmol/l；加 10mg／ml 蛋白酶K20ul，使最终浓度为200ug／ml，50E 保温30 分钟。 9）． 加等体积苯酚：氯仿混合液抽提，重复一次，去除蛋白酶K 及其它残留的蛋白质
至界面无明显的变性蛋白质为止。每次抽提轻缓地来回摇动5分钟，离心10000转/分钟X5分钟。10）：吸取水相，水相吸至一千净刻度离心管中量出积体，再加入2.5倍体积的冰无水乙醇，加5mol/LNaCI至终浓度为0.1mol/L，混匀后可得较纯的DNA沉淀，再用70%乙醇洗涤沉淀一次。11），在一干净的塑料离心管中用0.3一0.5ml缓冲液溶解沉淀，得到提纯的DNA原液。12）：吸取DNA原液100ul，用TE缓冲液稀释至3ml(1:30稀释），（若DNA原液太浓，取原液50ul，太稀则取原液200ul)。在紫外分光光度计中测定O.D260nm及O.D280nm的读数。计算：O.D260nm/O.D280nm比值，DNA浓度及DNA总量。4.注意事项1.为尽可能避免DNA大分子的断裂，在实验过程中必须(1)匀浆时应保持低温，匀浆时间应短，勿用玻璃匀浆器。(2)实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成钝口。(3)酚抽提时勿剧烈振摇。2)保持DNA活性，避免酸、碱或其它变性因素使DNA变性。，3)苯酚是一种强列的蛋白质变性剂。实验时，应戴手套操作，避免碰到皮肤，以免灼伤。苯酚蒸汽毒性较大，实验中应注意将盛酚的试剂瓶盖好。4）离心时要注意管于间的重量平衡。管于要对称放置，当离心达到所需速度后再开始计时。二、 血液DNA的提取1.材料颈静脉采血10ml，肝素抗凝，人灭菌小瓶，低温带回实验室。抗凝血样12000r/mir离心10min，将红细胞沉淀、白细胞沉淀及血清分离，白细胞沉淀移人5ml的离心管中并编号，血清移人样品瓶中编号，在仅剩红细胞沉淀的离心管中加入等体积的0.9%生理盐水，洗涤离心3次后移人样品瓶并编号，一20cC保存。2．实验步骤(1)在装有白细胞沉淀的5ml离心管中，加入细胞裂解液和蛋白酶K至终浓度为100g/ml，混勾，55cC水浴消化过夜至不见有黏稠的团块。(2)在消化好的血液中加入等体积Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10min使溶液的两相充分混匀，4cC12000r/min离心10min，转移上清至另一离心管中。(3)重复第二步。（4)向上清液中加入等体积的饱和酚一氯仿一异戊醇（25：24：1)混合液，缓慢颠倒离心管10min使溶液的两相充分混匀，4cC12000r/min离心10min，转移上清至另一离心管中。，(5)重复第四步。(6)向上清液中加入等体积氯仿、异戊醇（24：1)混合液，缓慢颠倒离心管10min使溶液的两相充分混匀，4cC12000r/min离心10min，转移上清至另一离心管中。(7)重复第六步。(8）向上清液中加入1/10体积3mo1/LNHAc（pH值5.2)和2倍体积的冰冻无水乙醇沉淀DNA，待出现白色雾状沉淀后，将离心管置于一20cC冰箱2～3h或轻柔摇荡至溶液变澄清，絮状DNA沉淀清晰可见。5
5 至界面无明显的变性蛋白质为止。每次抽提轻缓地来回摇动5 分钟，离心10000 转／分钟 X5 分钟。 10）．吸取水相，水相吸至一干净刻度离心管中量出积体，再加入2．5 倍体积的冰无水乙 醇，加5mol／LNaCl 至终浓度为0．1mol／L，混匀后可得较纯的DNA 沉淀，再用70％乙 醇洗涤沉淀一次。 11）. 在一干净的塑料离心管中用0．3—0．5ml 缓冲液溶解沉淀，得到提纯的DNA原液。 12）．吸取DNA 原液100ul，用TE 缓冲液稀释至3ml(1:30 稀释)，(若DNA 原液太浓，取 原液50ul，太稀则取原液200u1)。在紫外分光光度计中测定O.D260nm 及O.D280nm 的读数。 计算：O.D260nm／O.D280nm 比值，DNA 浓度及DNA 总 量。 4. 注意事项 1). 为尽可能避免DNA 大分子的断裂，在实验过程中必须 (1)匀浆时应保持低温，匀浆时间应短，勿用玻璃匀浆器。 (2)实验中使用的吸取DNA 水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成钝口。 (3)酚抽提时勿剧烈振摇。 2). 保持DNA 活性，避免酸、碱或其它变性因素使DNA 变性。 ， 3). 苯酚是一种强列的蛋白质变性剂。实验时，应戴手套操作，避免碰到皮肤，以免灼伤。 苯酚蒸汽毒性较大，实验中应注意将盛酚的试剂瓶盖好。 4). 离心时要注意管于间的重量平衡。管于要对称放置，当离心达到所需速度后再开始计时。 二、 血液DNA的提取 1. 材料 颈静脉采血10 ml，肝素抗凝，人灭菌小瓶，低温带回实验室。抗凝血样12 000 r／min 离心10 min，将红细胞沉淀、白细胞沉淀及血清分离，白细胞沉淀移人5 ml的离心管中并编 号，血清移人样品瓶中编号，在仅剩红细胞沉淀的离心管中加入等体积的0．9％ 生理盐水， 洗涤离心3次后移人样品瓶并编号，一20 cC保存。 2. 实验步骤 (1)在装有白细胞沉淀的5 ml离心管中，加入细胞裂解液和蛋白酶K至终浓度为100 g／ml， 混匀，55 cC水浴消化过夜至不见有黏稠的团块。 (2)在消化好的血液中加入等体积Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10 min使溶液的两相充分混 匀，4 cC 12 000 r／min离心10 min，转移上清至另一离心管中。 (3)重复第二步。 (4)向上清液中加入等体积的饱和酚一氯仿一异戊醇(25：24：1)混合液，缓慢颠倒离心管10 min使溶液的两相充分混匀，4 cC 12 000 r／min离心10min，转移上清至另一离心管中。 ’ (5)重复第四步。 (6)向上清液中加入等体积氯仿、异戊醇(24：1)混合液，缓慢颠倒离心管10 min使溶液的两 相充分混匀，4 cC 12 000 r／min离心10 min，转移上清至另一离心管中。 (7)重复第六步。 (8)向上清液中加入1／10体积3 mol／L NH Ac(pH值5．2)和2倍体积的冰冻无水乙醇沉淀DNA， 待出现白色雾状沉淀后，将离心管置于一20 cC冰箱2～3 h或轻柔摇荡至溶液变澄清，絮状 DNA沉淀清晰可见
(9)将DNA沉淀挑出，置于1、5ml离心管，75%乙醇洗涤2次，隔1h洗1次。（10)将DNA自然晾干后溶人适量TE或灭菌双蒸水中，55cC水浴消化2h，待完全溶解后置于一20cC保存。1.3DNA浓度与品质测定1.31琼脂糖凝胶电泳取TE溶解的DNA原液51，加2Ix1上样缓冲液，混匀，加入1%琼脂糖凝胶电泳，然后利用KODAK凝胶成像系统拍照，保存图片。1.3.2紫外分光光度计检测取20Ix1DNA愿液，加超纯水3m1，混匀，用紫外分光光度计测定样品OD260、OD27o、OD28o值。三、动物粪便中DNA的提取1.材料动物粪便样品在采集后立即装入灭过菌的离心管中，用DETs(DMSO/EDTA/Tris盐溶液）或无水乙醇浸泡。2.实验步骤将采集的粪便样品直接在样品管中揭碎，用均质法取样，每管取约200mg粪便进行DNA提取，提取前用0.9%的生理盐水预处理粪便以清除其中残留的乙醇。具体步骤如下：1）取200mg粪便于2mL离心管中，加入1mLCTAB裂解液（100mmolfLTfis一HC1，pH8，1.4mol/LNaC1，20mmol/LEDTA，2%CTAB)，混匀后55℃水浴2h；2）12000r/min离心5min，离心结束后移出700L上清至一无菌1.5m离心管中，弃沉淀。向上清中加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提；3)加入0.1倍体积的3mol/LNaAc，在旋涡混合器上混匀后加入1.5倍体积（加人盐之后计算的体积)预冷的无水乙醇，充分混匀后一20cI=放置0.5h～1h；4)12000r/min离心10min，吸弃上清，沉淀在室温中凉干；5）在沉淀中加入1mL异硫鼠酸胍（GuSCN)洗液（5mo1/LGuSCN，0.1mo1/LTris一HC1pH6.4)，摇匀至沉淀完全溶解：6)加入100ILL硅珠悬液，缓慢摇匀吸附DNA10min，10000r/min离心5min，吸弃上清；在硅珠沉淀中加入500IXLGuSCN洗液，混匀后10000r/min离心5min，吸弃上清并重复一次；7）离心弃上清，用500IXL70%乙醇重新洗涤沉淀2次：8）离心弃上清，将1.5m离心管置于55℃烘箱内5min烘干残余乙醇，再向硅珠沉淀中加入100LTE，震荡混匀5min洗脱DNA，最后12000r/min离心5min，移出约80L上清至无菌200txL或1.5mL离心管中保存。6
6 (9)将DNA沉淀挑出，置于1、5 ml离心管，75％ 乙醇洗涤2次，隔1 h洗1次。 (10)将DNA自然晾干后溶人适量TE或灭菌双蒸水中，55 cC水浴消化2 h，待完全溶解后置于 一20 cC保存。 1．3 DNA浓度与品质测定 1．3．1 琼脂糖凝胶电泳取TE溶解的DNA原液5 l，加2 Ixl上样缓冲液，混匀，加入1％琼脂 糖凝胶电泳，然后利用KODAK凝胶成像系统拍照，保存图片。 1．3．2 紫外分光光度计检测取20 Ixl DNA愿液 ，加超纯水3 ml，混匀，用紫外分光光度 计测定样品OD260、OD27o、OD28o值。 三、动物粪便中 DNA 的提取 l. 材料 动物粪便样品在采集后立即装入灭过菌的离心管中，用DETs(DMS0／EDTA／Tris盐溶液)或无 水乙醇浸泡。 2. 实验步骤 将采集的粪便样品直接在样品管中捣碎，用均质法取样 ，每管取约200 mg粪便进行DNA 提取，提取前用0．9％的生理盐水预处理粪便以清除其中残留的乙醇。具体步骤如下： 1) 取200mg粪便于2mL离心管中，加入l mLCTAB裂解液(100 mmolfL Tfis—HC1，pH 8，1．4 mol／L NaC1，20mmol／L EDTA，2％ CTAB)，混匀后55℃水浴2 h； 2)12 000 r／min离心5 min，离心结束后移出700L上清至一无菌1．5 mL离心管中，弃沉淀。 向上清中加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提； 3)加入0．1倍体积的3 mol／L NaAc，在旋涡混合器上混匀后加入1．5倍体积(加人盐之后计 算的体积)预冷的无水乙醇，充分混匀后一20 cI=放置0．5 h～1 h； 4)12 000 r／min离心10 min，吸弃上清，沉淀在室温中凉干； 5)在沉淀中加入1 mL异硫氰酸胍(GuSCN)洗液(5 mol／L GuSCN，0．1 mol／L Tris—HC1， pH 6．4)，摇匀至沉淀完全溶解； 6)加入100 ILL硅珠悬液，缓慢摇匀吸附DNA10 min，10 000 r／min离心5 min，吸弃上清； 在硅珠沉淀中加入500 IXL GuSCN洗液，混匀后10 000 r／min离心5 min，吸弃上清并重复 一次； 7)离心弃上清，用500 IXL 70％ 乙醇重新洗涤沉淀2次； 8)离心弃上清，将1．5 mL离心管置于55℃ 烘箱内5 min烘干残余乙醇，再向硅珠沉淀中加 入100L TE，震荡混匀5 min洗脱DNA，最后12 000 r／min离心5 min，移出约80 L上清至一 无菌200 txL或1．5 mL离心管中保存
四、从陈旧皮张提取DNA1.材料用于DNA提取的皮张样品2.DNA提取方法①剪取0.3cIr.2（约0.01g)左右的皮张标本，用消毒的解剖刀去除皮张表面的毛发及其它附着物②用消毒的剪刀将皮张剪成1～以下的微粒，置于Eppendof管中，以去离子水高速振荡洗涤三次，高速离心，倾去上层清液。③在每个Eppendof管中加入500出的消化液，54℃过夜（14h）。消化液：10mmt~11LTris—HC10.5%SDS，1mmoULCaCI~，02mglml蛋白酶K，pH8.0。④消化结束时，加入1出的1,umo11LEDTA（pH8.O）。③加入200110%的Chelex溶液，高速振荡混匀，置于沸水浴中20min4000drain离心5rain，取上清。?用等体积的酚，氯仿，异戊醇（25：24：1)抽提样品，4000rlmin离心10min，重复2～3次，③在DNA溶液中加入1，10体积3mo11L的NaAc溶液和2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置于一20屯，20rain。③12000dmin离心10mln，弃去上清。加入1ml预冷的75%乙醇，颠倒离心管数次，12000dmln离心3min，弃去上清。真空干燥，将干燥的沉淀物溶于适当体积的TE缓冲液中。在整个提取过程中，进行空白对比实验。7
7 四、 从陈旧皮张提取DNA 1. 材料 用于DNA提取的皮张样品 2. DNA提取方法 ①剪取0．3 cIr．2(约0．01 g)左右的皮张标本，用消毒的解剖刀去除皮张表面的毛发及其 它附着物 ② 用消毒的剪刀将皮张剪成1～ 以下的微粒，置于Eppendof管中，以去离子水高速振荡洗 涤三次，高速离心，倾去上层清液。 ③ 在每个Eppendof管中加入500出的消化液，54℃过夜(14 h)。消化液：10 mmt~llL Tris —HC1，0．5％ SDS，1 mmoUL CaCI~，0 2 mglml蛋白酶K，pH 8．0。 ④ 消化结束时，加入1出的1,umollL EDTA(pH 8．O)。 ⑤ 加入200 l 10％ 的Chelex溶液，高速振荡混匀，置于沸水浴中20 min ⑥4 000drain离心5 rain，取上清。 ⑦ 用等体积的酚，氯仿，异戊醇(25：24：1)抽提样品，4 000 rlmin离心10min，重复2～3 次， ⑧ 在DNA溶液中加入1，1O体积3mollL的NaAc溶液和2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置于一 2O屯，20rain。 ⑨ 12 000dmin离心10mln，弃去上清。 ⑩ 加入1 m1预冷的75％ 乙醇，颠倒离心管数次，12 000dmln离心3min，弃去上清。 ⑩ 真空干燥，将干燥的沉淀物溶于适当体积的TE缓冲液中。在整个提取过程中，进行空白 对比实验
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA1.实验原理带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。2.材料与器材(一)仪器1.恒温培养箱2.琼脂糖凝胶电泳系统3．小型高速离心机4.高压灭菌锅5.紫外核酸检测仪(二)材料1.pQE-31和pUC18-CAT质粒(三)试剂1.50xTAE（50倍体积的TAE贮存液）配1000mL50xTAE：Tris242g57mL冰醋酸0.5mol / L EDTA200mLpH 8. 02.凝胶加样缓冲液(6x)溴酚蓝0.25%燕糖40%3.琼脂糖4.溴化乙锭溶液（EB）0.5μg/mL5.250bpDNA分子量标准3.实验步骤(一)制备琼脂糖凝胶根据被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖凝胶浓度%线性DNA的有效分离范围/kb0. 35—600. 61—200. 70.81000
8 实验二 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 1. 实验原理 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为 分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵 敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子 在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通 过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光 条带，籍此可分析实验结果。 2. 材料与器材 (一)仪器 1．恒温培养箱 2．琼脂糖凝胶电泳系统 3．小型高速离心机 4．高压灭菌锅 5．紫外核酸检测仪 (二)材料 1．pQE-31 和 pUC18-CAT 质粒 (三)试剂 1．50xTAE(50 倍体积的 TAE 贮存液) 配 1000mL 50xTAE： Tris 242 g 冰醋酸 57 mL 0.5mol／L EDTA 200 mL pH 8.0 2．凝胶加样缓冲液(6x) 溴酚蓝 0.25％ 蔗糖 40％ 3．琼脂糖 4．溴化乙锭溶液(EB) 0.5µg／mL 5． 250bp DNA 分子量标准 3. 实验步骤 (一)制备琼脂糖凝胶 根据被分离 DNA 的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度％ 线性 DNA 的有效分离范围／kb 0.3 5—60 0.6 1—20 O.7 0.8—10
0. 90.5—71. 20.4—61. 50.2—42. 00.1—3实验用1.2%琼脂糖。称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL1xTAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。(二)胶板的制备1.取干净的有机玻璃内槽，用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。2.将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。3.将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。4.待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。5.加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。(三)加样用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔（记录点样顺序及点样量）。(四)电泳1：接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5V/cm。2.当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1一2cm处，停止电泳。(五)染色将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液（在200mL1xTAE缓冲液中加两滴2mg/mL的漠化乙锭储存液即可），在脱色摇床上缓慢摇动下染色20-30分钟。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。4.实验结果在紫外灯（360nm或254nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带（在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的伤害作用）。9
9 O.9 0.5—7 1.2 0.4—6 1.5 0.2—4 2.0 0.1—3 实验用 1.2％琼脂糖。称取 1.2g 琼脂糖，放入锥形瓶中，加入 100mL 1xTAE 缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。 (二)胶板的制备 1．取干净的有机玻璃内槽，用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严， 不能留缝隙)。 2．将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。 3．将冷到 60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上 形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。 4．待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽 内。注意：DNA 样品孔应朝向负电极一端。 5．加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面 1-1.5 毫米。 (三)加样 用移液枪将已加入上样缓冲液的 DNA 样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。 (四)电泳 1．接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA 的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度 不要超过 5V／cm。 2．当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 1—2cm 处，停止电泳。 (五)染色 将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在 200mL1xTAE 缓冲液中加两滴 2mg/mL 的 溴化乙锭储存液即可)，在脱色摇床上缓慢摇动下染色 20-30 分钟。注意：溴化乙锭 为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。 4. 实验结果 在紫外灯(360nm 或 254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处应显出桔红色荧光 条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的伤害作用)
实验三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外源蛋白的表达1.实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS一PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法。它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。打开的肽链靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同的大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。pGLO是将绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆在阿拉伯糖启动子之后的一种表达载体。携带有pGLO的大肠杆菌在含有相应诱导物和抗菌素的条件下培养，可以表达GFP，这比不加诱导物的同样的大肠杆菌在SDS一PAGE凝胶上要多出一条明显的条带。表达的蛋白也可用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，紫光灯下可以看到诱导后的样品在凝胶上有绿色荧光条带出现。还可以通过免疫印迹染色（Western一blotting）的方法，用GFP的抗体检测表达的外源蛋白。2.仪器、材料和试剂(一)仪器1.垂直板电泳槽及配套的玻璃板，梳子2.电泳仪3.干式恒温培养器4.微波炉(二)材料1．pGLO表达质粒转化的大肠杆菌的培养物：用阿拉伯糖诱导的和没有加阿拉伯糖诱导的(三)试剂1.1.5mol/LTris·HClpH8.8（已加SDS）2.0.5mo1/LTris·HCIpH6.8（已加SDS)3.10%SDS4.30%Acr/Bis29.2gAcr+08gBis，用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放。5.10%Ap(-20℃存放）6.2x样品缓冲液2mL0.5mol/LTris·HClpHb.8甘油2mL20%SDS2mL0.1%溴酚蓝0.5mL2—β—巯基乙醇1.0mL双蒸水2.5mL7.5x电极缓冲液Tris7.5gGly36gSDS2.5g双蒸水溶解，定容至500mL，使用时稀释5倍使用8.染色液：0.2g考马斯亮蓝R250+84mL95%乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用。10
10 实验三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外源蛋白的表达 1. 实验原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法。它 是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，使蛋白变 性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。打开的肽链靠疏水作用与 SDS 结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同的大小的肽 链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数 间成线形关系。 pGLO 是将绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆在阿拉伯糖启动子之后的一种表达载体。 携带有 pGLO 的大肠杆菌在含有相应诱导物和抗菌素的条件下培养，可以表达 GFP，这比 不加诱导物的同样的大肠杆菌在 SDS—PAGE 凝胶上要多出一条明显的条带。表达的蛋白 也可用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，紫光灯下可以看到诱导后的样品在凝胶上有绿 色荧光条带出现。还可以通过免疫印迹染色（Western—blotting）的方法，用 GFP 的抗体 检测表达的外源蛋白。 2. 仪器、材料和试剂 (一)仪器 1．垂直板电泳槽及配套的玻璃板，梳子 2．电泳仪 3．干式恒温培养器 4．微波炉 (二)材料 1． pGLO 表达质粒转化的大肠杆菌的培养物：用阿拉伯糖诱导的和没有加阿拉伯糖诱 导的 (三)试剂 1．1.5mo1／L Tris·HCl pH 8.8 (已加 SDS ) 2．0.5mo1／L Tris·HCl pH 6.8 (已加 SDS) 3．10％SDS 4．30％Acr／Bis 29.2g Acr + 0.8gBis，用双蒸水定容至 100mL，过滤备用，4℃存放。 5．10％Ap (-20℃存放) 6．2x 样品缓冲液 0.5mo1／L Tris·HCl pH6.8 2mL 甘油 2mL 20％SDS 2mL 0.1％溴酚蓝 0.5mL 2—β—巯基乙醇 l.0mL 双蒸水 2.5mL 7．5x 电极缓冲液 Tris 7.5g G1y 36 g SDS 2.5g 双蒸水溶解，定容至 500mL，使用时稀释 5 倍使用 8．染色液：0.2g 考马斯亮蓝 R250 + 84mL 95％乙醇 + 20mL 冰醋酸，定容至 200mL， 过滤备用