第二节重组体导入受体细胞的原理 与技术 重组DNA导入大肠杆菌的方法 、重组DNA导入真核细胞的方法 转化率及影响因素
第二节 重组体导入受体细胞的原理 与技术 一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 二、重组DNA导入真核细胞的方法 三、转化率及影响因素
重组DNA导入大肠杆菌的方法 相关概念 1转化( transformation) 细菌获得外源质粒DNA,产生新的遗传性状的过程 2转导( (transduction) 以噬菌体为媒介,将外源DNA导入细菌的过程。 3转染 transfection 指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组DNA分子 的过程。 转导和转染的区别 转导:通过噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA 转移到受体细胞的过程 转染:λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 相关概念 1.转化(transformation) 细菌获得外源质粒DNA，产生新的遗传性状的过程。 2.转导(transduction) 以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程。 3.转染 (transfection) 指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组DNA分子 的过程。 转导和转染的区别 转导：通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA 转移到受体细胞的过程。 转染：λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程
(-)转化 ( transformation) (1)热激法( heat shock) (2)电转化法( electroporation) (3)PEG介导的原生质体转化 (4)接合转化
（一）转化 （transformation） （1）热激法（heat shock） （2）电转化法（electronporation） （3）PEG介导的原生质体转化 （4）接合转化
重组DNA导入大肠杆菌的方法 1、化学转化法 DNA enters 感受态:细菌能从周围环境中吸收 DNA的生理状态称为感受态( competence)m DNA from 感受态的出现是由于细菌表面出现 another bacterial cell 许多DNA结合位点,这些位点只能与双 Bacterial chromosome (DNA) 链DNA结合,而不与单链DNA结合。这 (a)Transformation 说明完整的双链结构对于转化活性来说是 必要的 Pha 对于大肠杆菌细胞,一般采用aCl2溶 液来处理受体细胞,增加细胞膜的通透性, Fragment of DNA from 制备感受态细胞。 another bacterial cell (previous phage (b)Transduction
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 1、化学转化法 感受态：细菌能从周围环境中吸收 DNA的生理状态称为感受态(competence). 感受态的出现是由于细菌表面出现 许多DNA结合位点，这些位点只能与双 链DNA结合，而不与单链DNA结合。 这 说明完整的双链结构对于转化活性来说是 必要的。 对于大肠杆菌细胞，一般采用CaCl2溶 液来处理受体细胞，增加细胞膜的通透性， 制备感受态细胞
重组DNA导入大肠杆菌的方法 连接到细胞外壁的质粒 正常细菌 cacl2处理 感受态细胞 42C 2min 转入细胞的质粒 转化细胞 图5-3感受态细菌细胞对DNA的结合和吸收
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
重组DNA导入大肠杆菌的方法 细菌感受态细胞的制备过程 培养大肠 ODm至0.3 On ice 5-10 4℃离心收集 杆菌 0.4 mn On ice30用冰冷的 4℃离心收用冰冷的 mn 60 mMCac2重悬 集菌 60 mMCacl2重悬 4℃离心收集用冰冷的 分装、 60 mMCac2重悬 70℃冻存
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 细菌感受态细胞的制备过程 培养大肠 杆菌 OD600至0.3- 0.4 On ice 5-10 min 4℃离心收集 菌 用冰冷的 60mMCaCl2重悬 4℃离心收 集菌 4℃离心收集 菌 分装、 -70 ℃冻存 用冰冷的 60mMCaCl2重悬 On ice 30 min 用冰冷的 60mMCaCl2重悬
重组DNA导入大肠杆菌的方法 重组体导入受体细胞 简单,但转化效率不高(106-103/gDNA) 10ng载体DNA 吸附DNA 摄入DNA On ice混合,静 置30分钟 →|42C15分钟 100μL感受态菌 热休克法 10-100u转化液涂含抗 加入1mLLB培 菌素的平板 37℃摇1小时 养基
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 重组体导入受体细胞 10ng载体DNA 100L感受态菌 On ice混合，静 置30分钟 37℃摇1小时 10-100L转化液涂含抗 菌素的平板 吸附DNA 摄入DNA 加入1mL LB培 养基 42ºC 1.5分钟 热休克法 简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）
重组DNA导入大肠杆菌的方法 平板培养基培养细菌 10-100μL转化漩 z Suspension of 涂于合抗菌素的平板 Suspension spread on bacterial cells petri plate with agar gel Incubate from 1 to 2 days 37℃过夜 Petri plat with agar gel Single cells Visible colonies (not visible to naked eye) (each a clone of the corresponding single cell)
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 平板培养基培养细菌 10-100L转化液 涂于含抗菌素的平板 37℃过夜
重组DNA导入大肠杆菌的方法 2电击转化法 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转 化仪的样品池中,两极施加高压电场。 在强大电场的作用下,细菌细胞壁和细胞膜 生缝隙,质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 原理: 用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔,使各 种大分子(包括DNA)通过这些小孔进入细胞 转化效率高(高于10gDNA)
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 2.电击转化法 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转 化仪的样品池中，两极施加高压电场。 在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产 生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 原理: 用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使各 种大分子(包括DNA)通过这些小孔进入细胞. 转化效率高（高于109 /gDNA）
COno w □:■ Thymocytes