食品微生物学实验、实训指导 食品教研室、生物教研室组织编写 (内部使用) 漯河职业技术学院轻工系 食品加工技术专业使用 2006 年 12 月
食品微生物学实验、实训指导 食品教研室、生物教研室组织编写 (内部使用) 漯河职业技术学院轻工系 食品加工技术专业使用 2006 年 12 月
实验室安全守则 1.进入实验室工作衣、帽、鞋必须穿戴整齐。 2.在进行高压、干燥、消毒等工作时，实验人员不得擅自离开现场，认真观 察温度、时间，蒸馏易挥发、易燃液体时，不准直接加热，应置水浴锅上进行。 3.严禁用口直接吸取药品和菌液，按无菌操作进行，如发生菌液、病原体溅 出容器外时，应立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方能离开现场。 4.实验完毕，两手用清水肥皂洗净，必要时可用（杀菌剂）新洁尔灭、过氧 乙酸液浸泡手，然后用水冲洗，工作服应经常清洗，保持整洁，必要时高压消毒。 5.实验完毕，及时清理现场和实验用具，对染菌带毒物品，进行消毒灭菌处 理，并填写日常工作记录。 6.每日实验结束，认真检查水、相关电源是否关闭和正在使用的设备运转是 否正常，并认真记录。关好门窗，方可离去。 实验室检验总则 一、样品的采集 （一）采样目的 确保采集的样品能代表全部被检验的物质，使检验分析更具代表性。 （二） 采样原则 1.采集的样品要有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮 藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在，同时 能反映全部被检食品的组成、质量和卫生状况。 2.应设法保持样品原有微生物状况，在进行检验前不得污染，不发生变化。 3.采样必须遵循无菌操作程，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器 不得使用煤酚皂溶液，新洁尔灭、酒精等消毒物灭菌，更不能含有此类消毒药物， 以避免杀掉样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可使用。 （三）采样数量
实验室安全守则 1.进入实验室工作衣、帽、鞋必须穿戴整齐。 2.在进行高压、干燥、消毒等工作时，实验人员不得擅自离开现场，认真观 察温度、时间，蒸馏易挥发、易燃液体时，不准直接加热，应置水浴锅上进行。 3.严禁用口直接吸取药品和菌液，按无菌操作进行，如发生菌液、病原体溅 出容器外时，应立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方能离开现场。 4.实验完毕，两手用清水肥皂洗净，必要时可用（杀菌剂）新洁尔灭、过氧 乙酸液浸泡手，然后用水冲洗，工作服应经常清洗，保持整洁，必要时高压消毒。 5.实验完毕，及时清理现场和实验用具，对染菌带毒物品，进行消毒灭菌处 理，并填写日常工作记录。 6.每日实验结束，认真检查水、相关电源是否关闭和正在使用的设备运转是 否正常，并认真记录。关好门窗，方可离去。 实验室检验总则 一、样品的采集 （一）采样目的 确保采集的样品能代表全部被检验的物质，使检验分析更具代表性。 （二） 采样原则 1.采集的样品要有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮 藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在，同时 能反映全部被检食品的组成、质量和卫生状况。 2.应设法保持样品原有微生物状况，在进行检验前不得污染，不发生变化。 3.采样必须遵循无菌操作程，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器 不得使用煤酚皂溶液，新洁尔灭、酒精等消毒物灭菌，更不能含有此类消毒药物， 以避免杀掉样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可使用。 （三）采样数量
取样数量的确定，应考虑分析项目的要求、分析方法的要求及被检物的均匀 程度三个因素。样品应一式三份，分别供检验、复检及备查使用，每份样品数量 一般不少于 200g。 根据不同种类采样数量略有不同，实验室检验样品一般为 25 克。 （四）采样方法 1．采取随机抽样的方式。 2．直接食用的小包装食品，尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防 污染。 3． 如为非冷藏易腐食品，应迅速将所采样品冷却至 0－4℃。 4．不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖。 5．在将冷冻食品送到实验室前，要始终保持样品处于冷冻状态。样品一旦 融化，不可使其再冻，保持冷却即可。 （五）样品的保存和运送 1．样品采集完后，应迅速送往实验室检验，送检过程中一般不超过 3h，如 路程较远，可保存在 1－5℃环境中，如需冷冻者，则在冷冻状态下送检。 2．冷冻样品应存放在－15℃以下冰箱内；冷却和易腐食品应存放在 0－5℃ 冰箱或冷却库内；其它食品可放在常温冷暗处。 3．运送冷冻和易腐食品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。保证途 中样品不升温或不融化。 4．待检样品存放时间一般不应超过 36 小时。 二、检验样品的制备 （一）样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。 （二）检验冷冻样品前应先使其融化。可在 0－4℃融化，时间不超过 18 小 时，也可在温度不超过 45℃的环境中融化，时间不超过 15 分钟。 （三）检验液体或半固体样品前应先将其充分摇匀。如容器已装满，可迅速 翻转 25 次；如未装满，可于 7s 内以 30cm 的幅度摇动 25 次。从混样到检验间 隔时间不应超过 3min。 (四)开启样品包装前，先将表面擦干净，然后用 75％乙醇消毒开启部位及其 周围
取样数量的确定，应考虑分析项目的要求、分析方法的要求及被检物的均匀 程度三个因素。样品应一式三份，分别供检验、复检及备查使用，每份样品数量 一般不少于 200g。 根据不同种类采样数量略有不同，实验室检验样品一般为 25 克。 （四）采样方法 1．采取随机抽样的方式。 2．直接食用的小包装食品，尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防 污染。 3． 如为非冷藏易腐食品，应迅速将所采样品冷却至 0－4℃。 4．不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖。 5．在将冷冻食品送到实验室前，要始终保持样品处于冷冻状态。样品一旦 融化，不可使其再冻，保持冷却即可。 （五）样品的保存和运送 1．样品采集完后，应迅速送往实验室检验，送检过程中一般不超过 3h，如 路程较远，可保存在 1－5℃环境中，如需冷冻者，则在冷冻状态下送检。 2．冷冻样品应存放在－15℃以下冰箱内；冷却和易腐食品应存放在 0－5℃ 冰箱或冷却库内；其它食品可放在常温冷暗处。 3．运送冷冻和易腐食品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。保证途 中样品不升温或不融化。 4．待检样品存放时间一般不应超过 36 小时。 二、检验样品的制备 （一）样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。 （二）检验冷冻样品前应先使其融化。可在 0－4℃融化，时间不超过 18 小 时，也可在温度不超过 45℃的环境中融化，时间不超过 15 分钟。 （三）检验液体或半固体样品前应先将其充分摇匀。如容器已装满，可迅速 翻转 25 次；如未装满，可于 7s 内以 30cm 的幅度摇动 25 次。从混样到检验间 隔时间不应超过 3min。 (四)开启样品包装前，先将表面擦干净，然后用 75％乙醇消毒开启部位及其 周围
1．非粘性液体样品可用吸管吸取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基 内，吸管插入样品内的深度不应超过 2.5cm,也不得将吸有样品的吸管浸入稀释液 或培养基内。 2．粘性液体样品可用灭菌容器称取一定量，然后加入适量的稀释液或培养 基。 3.固体或半固体样品可用灭菌的均质杯称取一定量，再加适量的稀释液或培 养基进行均质，从样品的均质到稀释和接种，相隔时间不应超过 15 分钟。 三、检验 （一）实验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法 进行检验，检验过程中要认真、负责，严格进行无菌操作，避免环境中微生物污 染。 （二） 检验所使用的稀释液、试剂、培养基接触的一切器皿必须经过有效 的灭菌。 （三）实验室所用仪器、设备的性能应定期检查和校正。 （四）制备试剂和培养基所用的水，应为无离子水或用玻璃器皿蒸馏的蒸馏 水。 （五） 检验结束后，所有带菌的培养基、试剂、稀释液和器皿必须尽快灭 菌和洗刷。清洗过的器皿不应残留洗涤剂的痕迹。 四、检验记录和结果的报告 （一）经检验的每份样品都应有完整的检验记录。样品检验过程中所用方 法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验记录，以作为对结果分析、判定的 依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。 （二） 检验结束后，根据检验结果，及时填写检验报告书，签字并经负责 人审核签字后发出。 实验一 普通光学显微镜的构造和 使用 一、目的与要求 （一）学习普通光学显微镜的结构、各部分功能及使用方法。 （二）学习并掌握油镜的原理工科使用方法
1．非粘性液体样品可用吸管吸取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基 内，吸管插入样品内的深度不应超过 2.5cm,也不得将吸有样品的吸管浸入稀释液 或培养基内。 2．粘性液体样品可用灭菌容器称取一定量，然后加入适量的稀释液或培养 基。 3.固体或半固体样品可用灭菌的均质杯称取一定量，再加适量的稀释液或培 养基进行均质，从样品的均质到稀释和接种，相隔时间不应超过 15 分钟。 三、检验 （一）实验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法 进行检验，检验过程中要认真、负责，严格进行无菌操作，避免环境中微生物污 染。 （二） 检验所使用的稀释液、试剂、培养基接触的一切器皿必须经过有效 的灭菌。 （三）实验室所用仪器、设备的性能应定期检查和校正。 （四）制备试剂和培养基所用的水，应为无离子水或用玻璃器皿蒸馏的蒸馏 水。 （五） 检验结束后，所有带菌的培养基、试剂、稀释液和器皿必须尽快灭 菌和洗刷。清洗过的器皿不应残留洗涤剂的痕迹。 四、检验记录和结果的报告 （一）经检验的每份样品都应有完整的检验记录。样品检验过程中所用方 法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验记录，以作为对结果分析、判定的 依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。 （二） 检验结束后，根据检验结果，及时填写检验报告书，签字并经负责 人审核签字后发出。 实验一 普通光学显微镜的构造和 使用 一、目的与要求 （一）学习普通光学显微镜的结构、各部分功能及使用方法。 （二）学习并掌握油镜的原理工科使用方法
二、原理 普通光学显微镱由机械装置和光学系统 2 大部分构成。在光学系统中，物镱 的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜中配置的 几种物镱以油镱的放大倍数最大，与其它物镜相比，使用较特殊，需在载玻片与 镜头之间加滴镜油，以增加照明亮度和提高分辨率。 三、材料与仪器 （一）菌种 金黄色葡萄球菌及枯草杆菌染色玻片标本，啤酒酵母水浸片。 （二）其他 香柏油、二甲苯、显微镱、擦镜纸。 四、操作步骤 （一）显微镜的安置 置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘 3～ 4cm，镱检时姿势要端正。 （二）调节光源 安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明 亮度，而使用反光镱采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所 用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜度调节其角度，使视野内的光线均匀， 亮度适宜。 （三）低倍镜观察 将标本玻片置于载物台上，用标本夹住，移动推进器使 观察对象处在物镜的正下方，下降 10×物镜，使其接过标本，用粗调节器（粗 调螺旋）慢慢升起镜筒，出现图像后再用细调节器（细调螺旋）调节图像至清晰。 通过标本夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适目的物，仔细 观察。 （四）高倍镜观察 在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后 转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，以聚光镜器光圈及视野进行适当调节后 微调细调节器使物象清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录。 （五）油镜观察 在低倍镜或高倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节 器将镜筒升高约 2 厘米，然后在待观察区域滴加 1—2 滴香柏油，将油镜转到工 作位置，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎 与标本相接，将聚光器升至最高位置并开足光圈，用粗调节器将镜筒徐徐上升， 直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰为止。 （六）显微镜用后处理
二、原理 普通光学显微镱由机械装置和光学系统 2 大部分构成。在光学系统中，物镱 的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜中配置的 几种物镱以油镱的放大倍数最大，与其它物镜相比，使用较特殊，需在载玻片与 镜头之间加滴镜油，以增加照明亮度和提高分辨率。 三、材料与仪器 （一）菌种 金黄色葡萄球菌及枯草杆菌染色玻片标本，啤酒酵母水浸片。 （二）其他 香柏油、二甲苯、显微镱、擦镜纸。 四、操作步骤 （一）显微镜的安置 置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘 3～ 4cm，镱检时姿势要端正。 （二）调节光源 安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明 亮度，而使用反光镱采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所 用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜度调节其角度，使视野内的光线均匀， 亮度适宜。 （三）低倍镜观察 将标本玻片置于载物台上，用标本夹住，移动推进器使 观察对象处在物镜的正下方，下降 10×物镜，使其接过标本，用粗调节器（粗 调螺旋）慢慢升起镜筒，出现图像后再用细调节器（细调螺旋）调节图像至清晰。 通过标本夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适目的物，仔细 观察。 （四）高倍镜观察 在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后 转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，以聚光镜器光圈及视野进行适当调节后 微调细调节器使物象清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录。 （五）油镜观察 在低倍镜或高倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节 器将镜筒升高约 2 厘米，然后在待观察区域滴加 1—2 滴香柏油，将油镜转到工 作位置，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎 与标本相接，将聚光器升至最高位置并开足光圈，用粗调节器将镜筒徐徐上升， 直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰为止。 （六）显微镜用后处理
1、上升镜筒，取下载片。 2、用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残 留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。 3、用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。 4、将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八字形”再向下旋，同时 把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。 五、实验报告 （一）结果 分别绘出在不同物镜下观察到的不同的菌种的形态，同时注明 放大倍数。 （二）思考题 1．油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？ 2．显微镜中调节光线强弱的装置有哪些？ 实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色 一、目的与要求 （一）掌握染色的原理和操作过程 （二）掌握简单染色和革兰氏染色法 （三）熟练显微镜的使用技术 二、原理 由于菌体极小，折光率低，在显微镜下不容易看清，如将其染色，使菌体和 背景之间反差增大，折光率增强，就容易看清，简单染色法只用一种染料着色。 革兰氏染色法是细菌染色中一种重要的鉴别染色法。通过此法染色，可将细菌鉴 别为革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。其过程是：草酸铵结晶紫初染→路哥尔氏碘 液媒染→95%乙醇脱色→蕃红花红复染。若细胞能保持结晶紫与碘所形成的复合 物而不被乙醇脱色，则细菌呈紫色，称革兰氏阳性菌，若被乙醇脱色而被蕃红复 染成红色，则称革兰氏阴性菌， 三、材料与仪器 （一）革兰氏染色液（草酸铵结晶紫液＋路哥尔氏碘液＋95%乙醇＋蕃红花 红）、蒸馏水、菌落培养物（培养 18～24 小时）、二甲苯、香柏油
1、上升镜筒，取下载片。 2、用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残 留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。 3、用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。 4、将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八字形”再向下旋，同时 把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。 五、实验报告 （一）结果 分别绘出在不同物镜下观察到的不同的菌种的形态，同时注明 放大倍数。 （二）思考题 1．油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？ 2．显微镜中调节光线强弱的装置有哪些？ 实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色 一、目的与要求 （一）掌握染色的原理和操作过程 （二）掌握简单染色和革兰氏染色法 （三）熟练显微镜的使用技术 二、原理 由于菌体极小，折光率低，在显微镜下不容易看清，如将其染色，使菌体和 背景之间反差增大，折光率增强，就容易看清，简单染色法只用一种染料着色。 革兰氏染色法是细菌染色中一种重要的鉴别染色法。通过此法染色，可将细菌鉴 别为革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。其过程是：草酸铵结晶紫初染→路哥尔氏碘 液媒染→95%乙醇脱色→蕃红花红复染。若细胞能保持结晶紫与碘所形成的复合 物而不被乙醇脱色，则细菌呈紫色，称革兰氏阳性菌，若被乙醇脱色而被蕃红复 染成红色，则称革兰氏阴性菌， 三、材料与仪器 （一）革兰氏染色液（草酸铵结晶紫液＋路哥尔氏碘液＋95%乙醇＋蕃红花 红）、蒸馏水、菌落培养物（培养 18～24 小时）、二甲苯、香柏油
（二）载玻片、盖玻片、酒精灯、废液缸、洗瓶、吸水纸、接种环、显微镜、 镊子 （三）金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（12～16h），大肠杆菌。 四、操作程序 （一）简单染色法 涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检 1．涂片 取洁净载玻片，在中央滴一滴生理盐水（或无菌水），用接种环 以无菌操作挑取欲观察菌体，和水充分混匀，涂成极薄的菌膜。 2．干燥 室温自然干燥或略微加热干燥。 3．固定 涂面朝上，快速通过火焰 2—3 次（勿使涂片烫手）。 4．染色 放平染料，用自来水冲洗，直到涂片上流下的水无色为止。 6．干燥 自然干燥或吸水纸吸干，或用电吹风吹干。 （二）革兰氏染色法 涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫初染→水洗→碘液媒染→95%酒精脱色 20~30 秒→水洗→蕃红花红液复染→水洗干燥→镜检 1．涂片：先滴一小滴蒸馏水于载玻片中央，然后用接种环取少量菌体轻轻 混入水中，涂成一薄层并使细胞均匀分散。 2．干燥：在空气中令其自然干燥或在酒精灯火焰上端高处微微加温但勿靠 近火焰。 3．固定：把涂有细菌的面朝上，在酒精灯火焰上通过三次，目的是杀死菌 体细胞以及改变对染色剂的通透性，同时使涂片的菌体紧贴载玻片而不易被水冲 洗脱落。 4．初染：用草酸铵结晶紫液初染 1min，水洗、吸干。 5．媒染：加一滴路哥尔氏碘液媒染 1min、水洗。（此时结晶紫与碘液成复 合物） 6．脱色：斜置载玻片，用 95%酒精冲洗约 20～30s，立即水洗，吸干。 7．复染：用蕃红花红液复染 1～2min，水洗晾干或用吸水纸吸干。 8．镜检：在显微镜油浸镜下检查革兰氏阳性菌和阴性菌染色的差异，并观 察菌体形态。 （三）革兰氏染色成败的控制点
（二）载玻片、盖玻片、酒精灯、废液缸、洗瓶、吸水纸、接种环、显微镜、 镊子 （三）金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（12～16h），大肠杆菌。 四、操作程序 （一）简单染色法 涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检 1．涂片 取洁净载玻片，在中央滴一滴生理盐水（或无菌水），用接种环 以无菌操作挑取欲观察菌体，和水充分混匀，涂成极薄的菌膜。 2．干燥 室温自然干燥或略微加热干燥。 3．固定 涂面朝上，快速通过火焰 2—3 次（勿使涂片烫手）。 4．染色 放平染料，用自来水冲洗，直到涂片上流下的水无色为止。 6．干燥 自然干燥或吸水纸吸干，或用电吹风吹干。 （二）革兰氏染色法 涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫初染→水洗→碘液媒染→95%酒精脱色 20~30 秒→水洗→蕃红花红液复染→水洗干燥→镜检 1．涂片：先滴一小滴蒸馏水于载玻片中央，然后用接种环取少量菌体轻轻 混入水中，涂成一薄层并使细胞均匀分散。 2．干燥：在空气中令其自然干燥或在酒精灯火焰上端高处微微加温但勿靠 近火焰。 3．固定：把涂有细菌的面朝上，在酒精灯火焰上通过三次，目的是杀死菌 体细胞以及改变对染色剂的通透性，同时使涂片的菌体紧贴载玻片而不易被水冲 洗脱落。 4．初染：用草酸铵结晶紫液初染 1min，水洗、吸干。 5．媒染：加一滴路哥尔氏碘液媒染 1min、水洗。（此时结晶紫与碘液成复 合物） 6．脱色：斜置载玻片，用 95%酒精冲洗约 20～30s，立即水洗，吸干。 7．复染：用蕃红花红液复染 1～2min，水洗晾干或用吸水纸吸干。 8．镜检：在显微镜油浸镜下检查革兰氏阳性菌和阴性菌染色的差异，并观 察菌体形态。 （三）革兰氏染色成败的控制点
1．涂片厚度：涂片过厚，细胞重叠，无法较好地观察单个细菌细胞形态， 涂片过薄，细胞数量少，不利于观察； 2．染色时间。染色时间过长,结晶紫与细胞结合，脱色不易，染色不够，结 晶紫尚未与细胞结合。染色控制不好，易引起误判； 3．乙醇脱色的程度。如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够， 则阴性菌被误染为阳性菌。 五、实验报告 （一）结果 说明 3 株细菌的染色观察结果（形态、颜色革兰氏染色结果）。 （二）思考题 1．你认为制备细菌染色标本时，应注意哪些环节？ 2．哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 实验三 酵母菌形态观 察 一、目的与要求 观察酵母菌的形态及出芽繁殖方式。 二、原理 大小通常比细菌大几倍甚至十几倍，大多数的酵母以出芽方式进行无性繁 殖，有的二分裂繁殖。用美兰制成的水浸片，可观察酵母的形态和出芽繁殖方式 以及进行死活细胞的鉴别（染成蓝色的为死细胞，无色的为活细胞）。 三、材料与仪器 （一）啤酒酵母、假丝酵母、汉逊酵母。 （二）显微镜，载玻片、盖玻片、接种针、酒精灯。 （三）吕氏美蓝染液。 四、操作步骤 （一）在干净载玻片中央加一滴吕氏染色液，以无菌操作用接种环挑取少量 酵母菌体放于美蓝液中，混合均匀。 （二）取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下（以免 产生气泡），使其盖在菌液上，将多余菌液用吸水纸吸干
1．涂片厚度：涂片过厚，细胞重叠，无法较好地观察单个细菌细胞形态， 涂片过薄，细胞数量少，不利于观察； 2．染色时间。染色时间过长,结晶紫与细胞结合，脱色不易，染色不够，结 晶紫尚未与细胞结合。染色控制不好，易引起误判； 3．乙醇脱色的程度。如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够， 则阴性菌被误染为阳性菌。 五、实验报告 （一）结果 说明 3 株细菌的染色观察结果（形态、颜色革兰氏染色结果）。 （二）思考题 1．你认为制备细菌染色标本时，应注意哪些环节？ 2．哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 实验三 酵母菌形态观 察 一、目的与要求 观察酵母菌的形态及出芽繁殖方式。 二、原理 大小通常比细菌大几倍甚至十几倍，大多数的酵母以出芽方式进行无性繁 殖，有的二分裂繁殖。用美兰制成的水浸片，可观察酵母的形态和出芽繁殖方式 以及进行死活细胞的鉴别（染成蓝色的为死细胞，无色的为活细胞）。 三、材料与仪器 （一）啤酒酵母、假丝酵母、汉逊酵母。 （二）显微镜，载玻片、盖玻片、接种针、酒精灯。 （三）吕氏美蓝染液。 四、操作步骤 （一）在干净载玻片中央加一滴吕氏染色液，以无菌操作用接种环挑取少量 酵母菌体放于美蓝液中，混合均匀。 （二）取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下（以免 产生气泡），使其盖在菌液上，将多余菌液用吸水纸吸干
（三）将载玻片置于载物台上，先用低倍镜然后用高低倍镜观察酵母的形态 和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。 （四）染色约 0.5 小时后再进行观察，注意细胞数量是否增加。 五、实验报告 （一）结果 绘图说明你所观察到的酵母形态特征。 （二）思考题 1．在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？ 2．酵母水浸片制作时应注意什么？ 实验四 培养基的制备 一、目的与要求 （一）学习制备培养基的基本技术。 （二）制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。 二、原理 牛肉膏蛋白培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中 含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供作繁殖之用，制作固体 培养基时须加 2%琼脂，培养细菌时，应用稀酸或稀碱将 PH 调至中性或微碱性。 牛肉膏蛋白培养基的配方： 牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1%，NaCl0.5%，pH7.4～7.6。 三、材料与仪器 （一）试剂 牛肉膏，蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。 (二)其他 试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布， 棉花，牛皮纸，线绳，pH 试纸，电炉，台称。 四、操作步骤 （一）称量 根据用量按比例依次称取成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小 烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。 （二）溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，ZHU 一加入各成分， 使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。加热时应注意火力， 勿使培养基烧焦或溢出。溶好后，补足所需水分。 （三）调 PH 用 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCl 把 PH 调至所需范围
（三）将载玻片置于载物台上，先用低倍镜然后用高低倍镜观察酵母的形态 和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。 （四）染色约 0.5 小时后再进行观察，注意细胞数量是否增加。 五、实验报告 （一）结果 绘图说明你所观察到的酵母形态特征。 （二）思考题 1．在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？ 2．酵母水浸片制作时应注意什么？ 实验四 培养基的制备 一、目的与要求 （一）学习制备培养基的基本技术。 （二）制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。 二、原理 牛肉膏蛋白培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中 含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供作繁殖之用，制作固体 培养基时须加 2%琼脂，培养细菌时，应用稀酸或稀碱将 PH 调至中性或微碱性。 牛肉膏蛋白培养基的配方： 牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1%，NaCl0.5%，pH7.4～7.6。 三、材料与仪器 （一）试剂 牛肉膏，蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。 (二)其他 试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布， 棉花，牛皮纸，线绳，pH 试纸，电炉，台称。 四、操作步骤 （一）称量 根据用量按比例依次称取成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小 烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。 （二）溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，ZHU 一加入各成分， 使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。加热时应注意火力， 勿使培养基烧焦或溢出。溶好后，补足所需水分。 （三）调 PH 用 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCl 把 PH 调至所需范围
（四）过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如 无特殊要求时可省去此步骤。 （五）分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三解瓶内， 分装装置如实验图 8 所示；分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾染 棉塞引起污染。 1．液体分装 分装高度以试管高度的 1/4 左右为宜，分装三角瓶的量则根 据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的 1/2 为宜。 2．固体分装 分装试管，其装量不超过管高的 1/5，灭菌后制成斜面，斜 面长度不超过管长的 1/2。分装三解瓶，以不超过容积的 1/2 为宜。 3．半固体分装 装置以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。 （六）加棉塞 分装完毕后，在试管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞 及试管帽等，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性 能。 （七）包扎 棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。 （八）保存 灭菌后的培养基放入 37℃养箱中培养 24 小时，以检验灭菌 的效果，无污染方可使用。 五、实验报告 （一）结果 说明你配制培养基过程中的情况。 （二）思考题 1．培养基配制时应注意什么问题？为什么？ 2．分装培养基时为什么要使用弹簧夹？ 3．培养基配好后，为什么要立即灭菌？ 实验五 干热灭菌及高压蒸汽灭菌 一、目的与要求 了解干热灭菌及高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、原理 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变性而达到灭菌的目的，细 胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含 水量越大，则蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。因此与湿热灭菌相比
（四）过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如 无特殊要求时可省去此步骤。 （五）分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三解瓶内， 分装装置如实验图 8 所示；分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾染 棉塞引起污染。 1．液体分装 分装高度以试管高度的 1/4 左右为宜，分装三角瓶的量则根 据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的 1/2 为宜。 2．固体分装 分装试管，其装量不超过管高的 1/5，灭菌后制成斜面，斜 面长度不超过管长的 1/2。分装三解瓶，以不超过容积的 1/2 为宜。 3．半固体分装 装置以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。 （六）加棉塞 分装完毕后，在试管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞 及试管帽等，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性 能。 （七）包扎 棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。 （八）保存 灭菌后的培养基放入 37℃养箱中培养 24 小时，以检验灭菌 的效果，无污染方可使用。 五、实验报告 （一）结果 说明你配制培养基过程中的情况。 （二）思考题 1．培养基配制时应注意什么问题？为什么？ 2．分装培养基时为什么要使用弹簧夹？ 3．培养基配好后，为什么要立即灭菌？ 实验五 干热灭菌及高压蒸汽灭菌 一、目的与要求 了解干热灭菌及高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、原理 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变性而达到灭菌的目的，细 胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含 水量越大，则蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。因此与湿热灭菌相比