实验一 质粒的提取(碱法) 3学时
实验一 质粒的提取(碱法) 3学时
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论
实验目的 ⚫了解碱法提取质粒的原理； ⚫掌握碱法提取质粒的方法
实验目的 ⚫了解碱法提取质粒的原理； ⚫掌握碱法提取质粒的方法
实验原理 ⚫ 质粒是一种细菌染色体外的、具有自主 复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构 的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是 实验室常用的方法。 ⚫ 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来 分离它们
实验原理 ⚫ 质粒是一种细菌染色体外的、具有自主 复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构 的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是 实验室常用的方法。 ⚫ 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来 分离它们
结构的三大要素： • 多克隆位点 • 选择标记（耐药性，LacZ） • 独立的复制单位 种类： • 质粒 • 噬菌体 • 酵母人工染色体（YAC） • 反转录病毒载体 • 表达载体等
结构的三大要素： • 多克隆位点 • 选择标记（耐药性，LacZ） • 独立的复制单位 种类： • 质粒 • 噬菌体 • 酵母人工染色体（YAC） • 反转录病毒载体 • 表达载体等
259Ms1 252 8gll 237 HgiEll.Na1、 Pvul 280 Pvull 309 多克降位点 lecZ' 3000, M13 Pvull 631 orW正链 Am806 2674Eco0109 2622Awt相- pUC118/pUC119 个 (3.2kb) 1000 2501Spl 2299 Xmnl 2180 Scal ampr HgiEll 1387 2070Pvu1- 2060 Avall 1922 Mstl 多克隆位点 Bg1830 PUC118 Avall 1838 2 5 681 2 3 4 5 7 8 11 12 13 5 18 Pro Pro Leu ACG TCG GTA CCT CTA 06 TTG CTG Sacl Kpnl BamHl Xbal Psn Hincll PUC119 3 5 6 7 Thr 品 品 2 s8 ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA GAG GAT Ccc cGG ccG AGC TCG AAT San Xbal Accl al Hincll 在nlCI8由FnRI位点紧接王卫下游在nCI由Hind位坚控p下
pBC SK map
pBC SK map
T-载体
T-载体
• 在碱性条件（pH 12.5）下，线性染色体DNA 的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽 然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一 起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA 分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离 心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来， 而质粒DNA则留在上清液中。 • 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质 粒DNA
• 在碱性条件（pH 12.5）下，线性染色体DNA 的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽 然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一 起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA 分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离 心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来， 而质粒DNA则留在上清液中。 • 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质 粒DNA
实验仪器、材料与试剂 （一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器
实验仪器、材料与试剂 （一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器