流式 细脆 枚术 和流 知识扩充 式细胞仅 式细 脆仪 首页一第十一章流式细胞技术和流式细胞仪 一、荧光染料在流式细胞木中的及用 （一)碘化丙啶染色 碘化丙啶(propiolium iodide,PI)能嵌入NA双螺旋中，可使荧光强度增加约20倍， 以488m波长激发，DNA/PI复合物最大的发射波长约为615nm。 1.小佩Leis肺癌细胞DA含量测定方法 (1)从C57BL/6小鼠上切除肿块，在培养皿内用PBS冲洗。 (2)去除结缔组织及脂肪，剪碎肿块。 (3)小碎片移入1.20×38mm注射针，加压使其通过，于4℃条件下重悬细胞于BSS中。 (4)将200~300μL细胞悬液（⑤×10细胞/mL)中加入3mLPI(50μg/),染色3LL 细胞，于4℃存放20一30分钟。 (5)测定580~7501m之间的发射荧光，以去除末结合PI产生的激发光与发射光谱 线之间的重叠部分。 注：PI染色液：0.1%柠檬酸钠1000mL+PI5mg+1%Nonide P水。 2.培养细胞DNA的流式细胞仪分析 (1)从培养皿中吸去培养基，以BSS冲洗二次。 (2)加入PI5ml于培养皿中，在4℃放10分钟 (3)用吸管反复次打细胞，使细胞破坏，胞核释放出来，再行流式细胞仪分析。 3.完整细胞DNA的PI染色 (1)70%乙醇固定的细胞悬液，离心，去固定液。 (2)室温条件下加入P1染色一批细胞(10一10细胞/L),时间为30分钟，然后行 流式细胞仪分析。 （二)吖啶橙染色 1,DNA和RNM的鉴别染色
流 式 细 胞 技术 和 流 式 细 胞仪 流 式细胞仪 首页 → 第十一章 流式细胞技术和流式细胞仪 一、荧光染料在流式细胞术中的应用 （一）碘化丙啶染色 碘化丙啶(propiolium iodide，PI)能嵌入 DNA 双螺旋中，可使荧光强度增加约 20 倍， 以 488nm 波长激发，DNA/PI 复合物最大的发射波长约为 615nm。 1. 小鼠 Lewis 肺癌细胞 DNA 含量测定方法 （1）从 C57BL/6 小鼠上切除肿块，在培养皿内用 PBS 冲洗。 （2）去除结缔组织及脂肪，剪碎肿块。 （3）小碎片移入 1.20×38mm 注射针,加压使其通过,于 4℃条件下重悬细胞于 HBSS 中。 （4）将 200～300μL 细胞悬液(5×105 细胞/mL)中加入 3mL PI(50μg/mL)，染色 3LL 细胞，于 4℃存放 20～30 分钟。 （5）测定 580～750nm 之间的发射荧光，以去除末结合 PI 产生的激发光与发射光谱 线之间的重叠部分。 注：PI 染色液：0.1%柠檬酸钠 1000mL+PI 5mg + 1% Nonide P40 水。 2.培养细胞 DNA 的流式细胞仪分析 （1）从培养皿中吸去培养基，以 HBSS 冲洗二次。 （2）加入 PI5mL 于培养皿中，在 4℃放 10 分钟。 （3）用吸管反复次打细胞，使细胞破坏，胞核释放出来，再行流式细胞仪分析。 3. 完整细胞 DNA 的 PI 染色 （1）70%乙醇固定的细胞悬液，离心，去固定液。 （2）室温条件下加入 PI 染色一批细胞（105～106 细胞/mL），时间为 30 分钟，然后行 流式细胞仪分析。 （二）吖啶橙染色 1. DNA 和 RNA 的鉴别染色
利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色 固定，非固定细胞核酸，或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区 别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和R含量时较难获得好的重复性结果，但 该方法已被许多实验室广泛采用。方法如下： (1)试剂： 1)溶液A:低温保存，稳定期约2周。 Triton X-100(0.1%)0.1mL,1mol/L HCL 8mL 1mol/L NaCL15ml蒸馏水76mL,PH1.5(100mL) 2)溶液B:稳定期数月，最好除菌以后（高压或过滤）贮存。 0.01mol/L EDTA1OmL.1mol/L NaCL 15mL 0.4mol/L Na.HP0,31.5ml,0.2mo1/L柠檬酸18.5ml 蒸馏水24L,总体积为99mLp6.0 3)吖啶橙母液： 用吖啶橙/蒸馏水配成1g/L(致癌物，应小心)，吖啶橙应用液0.1nl母液加9.9L溶 液B稀释 4)注意事项：仪器鞘流系统应保持4℃。 氩激光激发波488nm,红色荧光为DNA(F>600nm),绿色荧光为RM或单链DNM(F>530nm) (2)方法： 1)用含15%血清的Ps配制细胞悬液，取0.2mL(8×10°细胞/mL),加入0.4L溶 液A,4C放置4560秒。 2)加1.2l含吖啶橙的溶液B,室温2分钟。 3)应在加入溶液B后10分钟内进流式细胞仪分析。 (3)注意事项：(1)细胞数保持恒定；(2)核酸与吖啶橙的比例：(3)染色时间 及温度。 2.单链和双链DNA的鉴别染色 (1)试剂： 1)HBSS内含1000u/LRNA酶A,0.2mo1/LKC1pH1.35 2)吖啶橙用0.1mol/L柠檬酸配成5g/L(16.7μm）,0.2mol/LNa0,缓冲液 pt2.6。 (2)方法 1)2X10细胞悬于1 mL.HBSS//RNase液中。 2)37℃温有1小时。 3)将0.2mL细胞悬液（含4X10细胞始终悬浮于HB5S/RNase)与0.5mL0.2m01/几 KC1(pH1.35)混匀，20℃30分钟。 4)加2L吖晾梧垫色2分钟」 5)绿色荧光(530mm)和红色荧光(600nm)分别代表细胞中单链及双链DNA含量。 (三)Hoechst33258染色
利用吖啶橙的变色特性可鉴别 DNA 和 RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色 固定，非固定细胞核酸，或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区 别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定 DNA 和 RNA 含量时较难获得好的重复性结果，但 该方法已被许多实验室广泛采用。方法如下： （1）试剂： 1）溶液 A：低温保存，稳定期约 2 周。 Triton X-100(0.1%) 0.1mL，1mol/L HCL 8mL 1mol/L NaCL 15ml 蒸馏水 76mL，PH 1.5（100mL） 2）溶液 B：稳定期数月，最好除菌以后(高压或过滤)贮存。 0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L NaCL 15mL 0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L 柠檬酸 18.5mL 蒸馏水 24mL，总体积为 99mL pH6.0 3）吖啶橙母液： 用吖啶橙/蒸馏水配成 1mg/mL(致癌物，应小心)，吖啶橙应用液 0.1mL 母液加 9.9mL 溶 液 B 稀释。 4）注意事项：仪器鞘流系统应保持 4℃。 氩激光激发波 488nm，红色荧光为 DNA(F>600nm),绿色荧光为 RNA 或单链 DNA(F>530nm) （2）方法： 1）用含 15%血清的 PBS 配制细胞悬液，取 0.2mL(8×106 细胞/mL)，加入 0.4mL 溶 液 A，4℃放置 45～60 秒。 2）加 1.2mL 含吖啶橙的溶液 B，室温 2 分钟。 3）应在加入溶液 B 后 10 分钟内进流式细胞仪分析。 （3）注意事项：（1）细胞数保持恒定；（2）核酸与吖啶橙的比例；（3）染色时间 及温度。 2. 单链和双链 DNA 的鉴别染色 （1）试剂： 1）HBSS 内含 1000u/mL RNA 酶 A，0.2mol/L KCl pH1.35 2）吖啶橙用 0.1mol/L 柠檬酸配成 5 mg/L(16.7μm),0.2mol/L Na2HPO4 缓冲液， pH2.6。 （2）方法 1）2×106 细胞悬于 1mL HBSS/RNase 液中。 2）37℃温育 1 小时。 3）将 0.2mL 细胞悬液(含 4×105 细胞始终悬浮于 HBSS/RNase)与 0.5mL 0.2mol/L KCl(pH1.35)混匀，20℃ 30 分钟。 4）加 2mL 吖啶橙染色 2 分钟。 5）绿色荧光(530nm)和红色荧光(600nm)分别代表细胞中单链及双链 DNA 含量。 （三）Hoechst33258 染色
以溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst3.3258染料进行细胞周期分析， 1.试剂： (1)用培养基配制33 ng/l.Brd及脱氧细胞苷26.4g/ml。 (2)染色液：Hoechst3:3258溶于PS,细胞染色24小时后进行分析，据报道染色 的稳定时间在30分钟至24小时之间。 2.方法： (1)将Brd加溶液按1：10加入细胞培养液中。 (2)根据细胞周期时间不同，选择不同时间培养的细胞 (3)孵育后，摇散细胞以传代培养。 (4)直接用染液重悬细胞，进入流式细胞仪分析。 Hoechst33258荧光值在410~580nm之间，需用330~360nm紫外光激发。应特异 性结合腺嘌吟胸腺嘧啶碱基对。因此，不仅特异性标记DNA,亦可标记胸腺嘧啶。在 细胞周期分析时，在与细胞孵有过程加入Brd山，Brd山可替代D中的胸腺嘧啶，因此， 处于合成期内的细胞表面上仍保持二倍体状态，并在分裂后G,峰的半峰处产生一新峰， 此项技术可用于直接测定细胞G,期及分裂时间。 (四)Hoechst33342染色 Hoechst33342染色活细胞DNA 1.试剂：Hoechst33342,用蒸馏水配成0.25mol/L。 2.方法： (1)制备10/m细胞悬液，以Hoechst33342染色，浓度为5~10g/L,室温下 20分钟。 (2)分析前切勿洗涤细胞。 Hoechst3.3342可用作细胞DNA的活体染料，据信可在保持细胞活性的同时，呈现 出相当好的DNA化学计量关系，激发波在紫外范围350~363nm之间，发射波则在450nm 处。 (五)异硫氰酸荧光素染色 以异疏氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyante,FITC)染色蛋白质。 1.试剂：FITC用含40g/L RNase的PBS配成0.1~1.0g/L浓度 2.方法： (1)染色前用终浓度70%乙醇固定细胞，至少18小时 (②)离心固定细胞，弃去固定液。 (3)室温下用FIFC染色细胞蛋白，30分钟。 (4)流式细胞仪分析，使用氩激光，激发波长488nm.荧光发射波长515一535nm。 也可于固定细胞中，以18g/L(0.1%柠檬酸盐配制)和0.05g/LFIFC(含40mg1 Nase,PBS配制)染色20分钟以上可对DNA和蛋白质双重染色，分别呈现红色荧光(DNA) 和绿色荧光（蛋白质）
以溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)和 Hoechst33258 染料进行细胞周期分析。 1.试剂： （1）用培养基配制 33 mg/L Brdu 及脱氧细胞苷 26.4g/mL。 （2）染色液：Hoechst33258 溶于 PBS，细胞染色 24 小时后进行分析，据报道染色 的稳定时间在 30 分钟至 24 小时之间。 2.方法： （1）将 Brdu 溶液按 1:10 加入细胞培养液中。 （2）根据细胞周期时间不同，选择不同时间培养的细胞。 （3）孵育后，摇散细胞以传代培养。 （4）直接用染液重悬细胞，进入流式细胞仪分析。 Hoechst33258 荧光值在 410～580nm 之间，需用 330～360nm 紫外光激发。应特异 性结合腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对。因此，不仅特异性标记 DNA，亦可标记胸腺嘧啶。在 细胞周期分析时，在与细胞孵育过程加入 Brdu,Brdu 可替代 DNA 中的胸腺嘧啶，因此， 处于合成期内的细胞表面上仍保持二倍体状态，并在分裂后 G1 峰的半峰处产生一新峰， 此项技术可用于直接测定细胞 G2 期及分裂时间。 （四）Hoechst33342 染色 Hoechst33342 染色活细胞 DNA 1.试剂：Hoechst 33342,用蒸馏水配成 0.25mol/L。 2.方法： （1）制备 106 /m 细胞悬液，以 Hoechst33342 染色，浓度为 5～10 mg/L ，室温下 20 分钟。 （2）分析前切勿洗涤细胞。 Hoechst33342 可用作细胞 DNA 的活体染料，据信可在保持细胞活性的同时，呈现 出相当好的 DNA 化学计量关系，激发波在紫外范围 350～363nm 之间，发射波则在 450nm 处。 （五）异硫氰酸荧光素染色 以异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyante，FITC）染色蛋白质。 1.试剂： FITC 用含 40 mg/L RNase 的 PBS 配成 0.1～1.0 mg/L 浓度。 2.方法： (1)染色前用终浓度 70%乙醇固定细胞，至少 18 小时。 (2)离心固定细胞，弃去固定液。 (3)室温下用 FIFC 染色细胞蛋白，30 分钟。 (4)流式细胞仪分析，使用氩激光，激发波长 488nm，荧光发射波长 515～535nm。 也可于固定细胞中，以 18 mg/L (0.1%柠檬酸盐配制)和 0.05 mg/L FIFC(含 40 mg/L RNase，PBS 配制)染色 20 分钟以上可对 DNA 和蛋白质双重染色，分别呈现红色荧光（DNA） 和绿色荧光（蛋白质）
（六)若丹明染色 若丹明标记单克隆抗体的应用 该技术既可用于检测带有特异性膜抗原的细胞，可用若丹明标记单克隆抗体处理上 述细胞：也可用于测定胞浆中的蛋白质（如调亡CL-2蛋白，抗病毒蛋白MA等）。 1.说明：用磷酸盐缓冲液agle'sMEM稀释FITC连接的抗体内含0.1%叠氯钠、2% 牛血清。为判定FITC抗体的最适度的稀释浓度，向微量滴定板的细胞中加入50μL不 同浓度的稀释液，再以荧光显微镜确认最佳染色浓度。使用抗人L-I抗体分析时，应 稀释成5mg/儿或0.25mg/儿。无论鼠或人细胞在2×10浓度时其存活率应在90%以上。 2.方法： (1)于微量滴定板加入50μL若丹明标记的抗体，再加入50μL细胞悬液，混匀. (2)冰浴45分钟，离心滴定板(1500r/min10分钟)。 (3)弃上清，以培养基100μL洗涤细胞沉淀2次，每次洗涤后用1500r/min10分钟 弃上清。 (4④)以1l预冷的培养基配成1×10细胞/L的已染色细胞悬液，进样前持续保持冷 环境(4℃)。 (七)光辉霉素和PI的双标记DNA染色 在荧光抗生素光辉霉素和PI联合染色过程中，光辉霉素的供体分子被PI的受体分 子接受产生能量转移，该染色技术主要用于实体肿瘤组织，精子细胞及妇科标本，同时 也适用于体外培养的细胞。 1,分离制备的细胞悬液即可使用，若用70%乙醇固定可保存一周。 2.以P1/光辉霉素染色，4℃1小时(PI为10mg/L、光辉霉素为10mg/L)。 3.染色后进样，以100汞灯作为激光光源，使用BG123m阻断滤片，叠加K590型 高通滤法。 (八)PI和FITC对DNA与癌基因探针双标记测定 1说明：这种测定是先用癌基因探针按间接免疫荧光染色法标记癌基因表达产 物，然后用PI标记NA,现以研究白血病细胞增殖与癌基因的关系说明操作步骤： 2.方法： (1)制各白血病细胞悬液，用100%甲醇在-20℃固定10分钟 (2)取50μ150mg/L的癌基因探针Y13-25(它是一种广谱单克隆抗体，可特异性 地直接与N-ras,Ki-ras和Ha-ras三种癌基因编码的21Kd蛋白相结合)，4℃作用30~ 45分钟。 (3)用PB离心洗涤2次，重悬浮于50μLBSS中（含0.1%叠氮钠和2%小牛血清）。 (4)加入50μL1:200兔抗鼠IgG,4℃放置30~45分钟。 (⑤)同(3)洗涤后加入50μL1:40的FITC标记的羊抗兔IgG,4℃反应30~45分
（六）若丹明染色 若丹明标记单克隆抗体的应用 该技术既可用于检测带有特异性膜抗原的细胞，可用若丹明标记单克隆抗体处理上 述细胞；也可用于测定胞浆中的蛋白质(如凋亡 BCL-2 蛋白，抗病毒蛋白 MXA 等)。 1.说明：用磷酸盐缓冲液 Eagle's MEM 稀释 FITC 连接的抗体内含 0.1%叠氮钠、2% 牛血清。为判定 FITC 抗体的最适度的稀释浓度，向微量滴定板的细胞中加入 50μL 不 同浓度的稀释液，再以荧光显微镜确认最佳染色浓度。使用抗人 LEU-I 抗体分析时，应 稀释成 5 mg/L 或 0.25 mg/L。无论鼠或人细胞在 2×107 浓度时其存活率应在 90%以上。 2.方法： (1)于微量滴定板加入 50μL 若丹明标记的抗体，再加入 50μL 细胞悬液，混匀。 (2)冰浴 45 分钟，离心滴定板（1500r/min 10 分钟）。 (3)弃上清，以培养基 100μL 洗涤细胞沉淀 2 次，每次洗涤后用 1500r/min 10 分钟， 弃上清。 (4)以 1ml 预冷的培养基配成 1×106 细胞/mL 的已染色细胞悬液，进样前持续保持冷 环境(4℃)。 （七）光辉霉素和 PI 的双标记 DNA 染色 在荧光抗生素光辉霉素和 PI 联合染色过程中，光辉霉素的供体分子被 PI 的受体分 子接受产生能量转移，该染色技术主要用于实体肿瘤组织，精子细胞及妇科标本，同时 也适用于体外培养的细胞。 1.分离制备的细胞悬液即可使用，若用 70%乙醇固定可保存一周。 2．以 PI/光辉霉素染色，4℃ 1 小时（PI 为 10 mg/L、光辉霉素为 10 mg/L）。 3．染色后进样，以 100W 汞灯作为激光光源，使用 BG123nm 阻断滤片，叠加 K590 型 高通滤法。 （八）PI 和 FITC 对 DNA 与癌基因探针双标记测定 1. 说明：这种测定是先用癌基因探针按间接免疫荧光染色法标记癌基因表达产 物，然后用 PI 标记 DNA，现以研究白血病细胞增殖与癌基因的关系说明操作步骤： 2.方法： （1）制备白血病细胞悬液，用 100%甲醇在-20℃固定 10 分钟。 (2) 取 50μl50 mg/L 的癌基因探针 Y13-25(它是一种广谱单克隆抗体，可特异性 地直接与 N-ras，Ki-ras 和 Ha-ras 三种癌基因编码的 21Kd 蛋白相结合)，4℃作用 30～ 45 分钟。 (3) 用 PB 离心洗涤 2 次，重悬浮于 50μL HBSS 中(含 0.1%叠氮钠和 2%小牛血清)。 (4) 加入 50μL 1:200 兔抗鼠 IgG，4℃放置 30～45 分钟。 (5) 同(3)洗涤后加入 50μL 1:40 的 FITC 标记的羊抗兔 IgG，4℃反应 30～45 分 钟
(6)同(3)洗涤后，细胞用RNA酶消化，室温20~30分钟 (7)同(3)洗涤后，用P1染液染20分钟。 (8)同(3)洗涤后，用488mm激发波长测定。FITC染色显示ras癌基因表达产物 PI染色显示DNM含量。 3.注意事项： ()制备样品时，离心次数不宜过多，防止细胞丢失和凝集： (2)细胞周定时间不宜过长，不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞周定剂 (3)为了降低本底，应将细胞表面未结合的荧光染料洗净： (4)进行双标记沉淀时，应尽量选用激发光谱不接近的荧光色素 二、记活相隐免度荧光枝木一流式细聪仪标本的制各 流式细胞仪(FC)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等 高技术发展起来的一种先进仪器，己广泛应用于免疫学、生物化学、生物学 肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标 可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确 分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于℉CM检 测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下， 活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧 光的结果。 (一)原理 活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体 与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧 光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。 (仁)操作步骤 制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、 脾细胞等均可用于本法) 用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10°~1X10/ml 取40u1细胞悬液加入预先有特异性McAb(5~50μ1)的小玻璃管或塑料 离心管，再加50μ11：20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清 14"℃30min 用洗涤液洗涤2次， 每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min 弃上清，加入50μ1工作浓度的羊抗鼠（或兔抗鼠）荧光标记 物，充分振摇 ↓4C30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右，1000rpm×5mim
(6) 同(3)洗涤后，细胞用 RNA 酶消化，室温 20～30 分钟。 (7) 同(3)洗涤后，用 PI 染液染 20 分钟。 (8) 同(3)洗涤后，用 488nm 激发波长测定。FITC 染色显示 ras 癌基因表达产物， PI 染色显示 DNA 含量。 3. 注意事项： （1）制备样品时，离心次数不宜过多，防止细胞丢失和凝集； （2）细胞固定时间不宜过长，不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定剂； （3）为了降低本底，应将细胞表面未结合的荧光染料洗净； （4）进行双标记沉淀时，应尽量选用激发光谱不接近的荧光色素。 二、记活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等 高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、 肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标 志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确 分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于 FCM 检 测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下， 活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧 光的结果。 (一) 原理 活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体 与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧 光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。 (二) 操作步骤 制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、 脾细胞等均可用于本法) ↓ 用 10％FCS RPMI1640 调整细胞浓度为 5×10６～１×107／ml ↓ 取 40μl 细胞悬液加入预先有特异性 McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料 离心管，再加 50μl 1∶20(用 DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤 2 次，每次加洗涤液 2ml 左右 1000rpm×5min ↓ 弃上清，加入 50μl 工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记 物，充分振摇 ↓ 4℃ 30min 用洗涤液洗涤 2 次，每次加液 2ml 左右，1000rpm×5min ↓
加适量固定液（如为℉CM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧 光显微镜下观察，视细胞浓度加入100~500μ1固定液) FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5~7天） (三)试剂和器材 1。名种特异性单克降抗体。 23 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清 10%FCS 1640,DPBS、洗涤液， 周定液（见附录）。 4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 (四)注意事项 L.整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ,上述实验条件是防止 膜抗原 发生 资涤烫充分，以离抗体抗股用结合，出现 假阴性。 .加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防 止非特异性染色。 4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 1.DPBS(×10,贮存液)、NaC180g、KC12g、蒸馏水加至1000ml, NaHP0,11.5g临用时用蒸馏水1：10稀释，KHP042g 2.洗涤液：DPBS900ml、FCS50ml(终浓度5%)、4%NaN:50ml(终 浓度0.2%) 3.固定液：DPBS1000ml、葡萄糖20g(终浓度2%)、甲醛10ml、 NaN,0.2g(终浓度0.02%) (撰稿金伯泉)
加适量固定液(如为 FCM 制备标本，一般加入 1ml 固定液，如制片后在荧 光显微镜下观察，视细胞浓度加入 100～500μl 固定液) ↓ FCM 检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存 5～7 天) (三) 试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 (四) 注意事项 1.整个操作在 4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高 10 倍的 NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现 假阴性。 3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白 Fc 受体，降低和防 止非特异性染色。 4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)、NaCl 80g、KCl 2g 、蒸馏水加至 1000ml， Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水 1∶10 稀释，KH２PO４ 2g 2. 洗涤液：DPBS 900ml、FCS 50ml (终浓度 5％)、4％NaN３ 50ml (终 浓度 0.2％) 3. 固定液：DPBS 1000ml、葡萄糖 20g (终浓度 2％)、甲 醛 10ml、 NaN３ 0.2g (终浓度 0.02％) （撰稿 金伯泉）