第六章第八节 分子生物学方法 及其在中医研究中应用
第六章 第八节 分子生物学方法 及其在中医研究中应用
一，中医药实验研究为什么要采用分子生物学技术 1.一些不同的认识 2.中医药实验研究采用分子生物学技术的必要性
一．中医药实验研究为什么要采用分子生物学技术 1．一些不同的认识 2．中医药实验研究采用分子生物学技术的必要性
(1)振兴中医的重要机遇 分子生物学、细胞生物学以其实验条件便于控制、 实验稳定、重复性好、实验周期短、仪器试剂（包括各 类试剂盒)发展快，手段丰富、国际研究普遍（使新方 法、新技术层出不穷)、研究积累快、参考文献丰富， 可以观察人体的不同组织的细胞、分子（这又强于动物 实验)，给应用该方法技术研究创造了绝佳的条件。 业已进行的研究揭示和开拓出生命科学广大的未知 领域。 由于分子生物学新兴、发展快，给国内外、中西医 创造了同等的发展和应用的机会，再次使中、西医有可 能站到同一起跑线上。抓住这个千载难逢的机会，充分 利用它、驾御它，必将给中医学注入强大的生命
（1）振兴中医的重要机遇 分子生物学、细胞生物学以其实验条件便于控制、 实验稳定、重复性好、实验周期短、仪器试剂（包括各 类试剂盒）发展快，手段丰富、国际研究普遍（使新方 法、新技术层出不穷）、研究积累快、参考文献丰富， 可以观察人体的不同组织的细胞、分子（这又强于动物 实验），给应用该方法技术研究创造了绝佳的条件。 业已进行的研究揭示和开拓出生命科学广大的未知 领域。 由于分子生物学新兴、发展快，给国内外、中西医 创造了同等的发展和应用的机会，再次使中、西医有可 能站到同一起跑线上。抓住这个千载难逢的机会，充分 利用它、驾御它，必将给中医学注入强大的生命
(2)保持中医药优势的需要 几千年来，中医在运用天然药物方面积累了丰富的经 验。比如其中一些天然动植物药物的粗制品，比如水蛭素 、蛇毒抗栓酶类粗制品已经作为我国的传统医药产业。但 是当国外采用了分子生物学技术和生物工程，生产出水蛭 素、类凝血酶素，既降低了成本，又提高了质量的稳定性 。反销我国和国际市场，对我国传统医药产业形成了巨大 竞争。有识之士开始呼吁不能坐视祖国医学优秀遗产的优 势失去，主张抓紧采用分子生物学研究天然中药的有效成 分，开发新药，不然势将失去优势。通过几十年的研究， 中药所面临的问题已经暴露得十分清楚，比如中药材的质 量稳定、占用耕地、有效成分和若干有效成分最佳组合的 探索、有效成分得率需要提高，以及服用的安全、方便等 均有赖于大量的中药学基础研究，而已有的研究表明，分 子生物学是十分重要、有效的研究手段
（2）保持中医药优势的需要 几千年来，中医在运用天然药物方面积累了丰富的经 验。比如其中一些天然动植物药物的粗制品，比如水蛭素 、蛇毒抗栓酶类粗制品已经作为我国的传统医药产业。但 是当国外采用了分子生物学技术和生物工程，生产出水蛭 素、类凝血酶素，既降低了成本，又提高了质量的稳定性 。反销我国和国际市场，对我国传统医药产业形成了巨大 竞争。有识之士开始呼吁不能坐视祖国医学优秀遗产的优 势失去，主张抓紧采用分子生物学研究天然中药的有效成 分，开发新药，不然势将失去优势。通过几十年的研究， 中药所面临的问题已经暴露得十分清楚，比如中药材的质 量稳定、占用耕地、有效成分和若干有效成分最佳组合的 探索、有效成分得率需要提高，以及服用的安全、方便等 均有赖于大量的中药学基础研究，而已有的研究表明，分 子生物学是十分重要、有效的研究手段
中药的研究有赖于中医基础的研究，而不加强分子生 物学技术对中医基础的研究，没有强大的基础研究的积累 和支撑，药物的研究、开发将成为无本之木。 (3)继承和发展中医基础理论的需要 中医药的作用发挥，脏腑病机的变化、不同治法（具 体落实到中药复方及其有效成分，针灸、推拿等治疗方法 )的作用环节和最终作用的发挥，均落实到人体基因转录 与表达的调控。已有的研究表明，中医药的取效，往往是 通过对基因的转录与表达调控实现的。甚至，一些基因缺 失或突变所引起的疾病，中医药通过对其它有关基因的转 录调控，进行补偿，达到治疗疾病的目的。深入研究对于 阐明中医药的作用机制、阐明生命的调控原理，均具有重 要的科学意义。作为对中医学优秀遗产的继承和发展，这 部分的研究具有广阔的天地，是中医基础理论研究的重头
中药的研究有赖于中医基础的研究，而不加强分子生 物学技术对中医基础的研究，没有强大的基础研究的积累 和支撑，药物的研究、开发将成为无本之木。 （3）继承和发展中医基础理论的需要 中医药的作用发挥，脏腑病机的变化、不同治法（具 体落实到中药复方及其有效成分，针灸、推拿等治疗方法 ）的作用环节和最终作用的发挥，均落实到人体基因转录 与表达的调控。已有的研究表明，中医药的取效，往往是 通过对基因的转录与表达调控实现的。甚至，一些基因缺 失或突变所引起的疾病，中医药通过对其它有关基因的转 录调控，进行补偿，达到治疗疾病的目的。深入研究对于 阐明中医药的作用机制、阐明生命的调控原理，均具有重 要的科学意义。作为对中医学优秀遗产的继承和发展，这 部分的研究具有广阔的天地，是中医基础理论研究的重头
二.分子生物学的主要技术和方法 (一)载体 载体的使用目的： )重组基因，以便放大某一基因片段，用于探针、基 因功能检测、报道基因研究等。方法是：把某一DNA片段插 入到相应的载体（比如质粒、噬菌体、哺乳类细胞表达载 体等)，给予扩增，用以标记探针、测序、cDNA库建立、 基因功能检测等多种分子生物学实验。因此重组质粒就成 为中医药实验研究中最为常规的实验。 通常，扩增目的DNA主要借助两类方法，即PCR技术和 载体重组技术，鉴于PC技术受到酶的性能和方法学等多方 面的限制，某些DNA和超过一定长度DNA的扩增会有困难， 所以载体重组技术倍受青睐
二．分子生物学的主要技术和方法 （一）载体 载体的使用目的： 1）重组基因，以便放大某一基因片段，用于探针、基 因功能检测、报道基因研究等。方法是：把某一DNA片段插 入到相应的载体（比如质粒、噬菌体、哺乳类细胞表达载 体等），给予扩增，用以标记探针、测序、cDNA库建立、 基因功能检测等多种分子生物学实验。因此重组质粒就成 为中医药实验研究中最为常规的实验。 通常，扩增目的DNA主要借助两类方法，即PCR技术和 载体重组技术，鉴于PCR技术受到酶的性能和方法学等多方 面的限制，某些DNA和超过一定长度DNA的扩增会有困难， 所以载体重组技术倍受青睐
2)DDPCR产物的克隆和测序。 3)RACE PCR产物的克隆和测序。 4)构建基因库、CDNA库，等。 5)基因功能检测 6)基因工程（包括基因治疗之类） 1.质粒。质粒是一类双链、闭环的DNA分子，长度为 3kb左右，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行 复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造，使实验室常用 质粒具备了以下几种特性：1)含有多克隆位点区域，可 方便的插入目的DNA片段。2)对细菌的可转移性，即在实 验中，可将质粒诱导入细菌。3)选择标记。常用的有抗 生素抗性基因
2）DDPCR产物的克隆和测序。 3）RACE PCR产物的克隆和测序。 4）构建基因库、cDNA库，等。 5）基因功能检测。 6）基因工程（包括基因治疗之类）。 1．质粒。质粒是一类双链、闭环的DNA分子，长度为 3kb左右，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行 复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造，使实验室常用 质粒具备了以下几种特性：1）含有多克隆位点区域，可 方便的插入目的DNA片段。2）对细菌的可转移性，即在实 验中，可将质粒诱导入细菌。3）选择标记。常用的有抗 生素抗性基因
这样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗 生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代， 如此，便于鉴定质粒诱导入细菌成功与否。4)在细菌体 内可获得较高的拷贝数，例如一种叫pUC的质粒，在单一 细菌体中的拷贝数可达500-700个。因此质粒已成为分子 生物学中应用最为广泛的载体
这样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗 生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代， 如此，便于鉴定质粒诱导入细菌成功与否。4）在细菌体 内可获得较高的拷贝数，例如一种叫pUC的质粒，在单一 细菌体中的拷贝数可达500-700个。因此质粒已成为分子 生物学中应用最为广泛的载体
2.λ噬菌体。入噬菌体的基因组是一组长度约为 5Okb的双链DNA分子。在入噬菌体颗粒内，该DNA为一双 链分子，其末端为长12个核苷酸的互补单链（粘端）。当 λ噬菌体进入宿主细胞后，其粘端通过碱基配对而结合 ,形成环状分子，相隔12bp有两个交错切口。宿主体内 的DNA连接酶很快将切口封闭而形成闭环DNA分子，该DNA 分子在感染早期充当转录模板。实验用入噬菌体，在其 DNA的中部有一可取代区，含多克隆位点，供插入DNA之 用。入噬菌体较质粒的优点在于可插入较大的DNA片段， 如有的入噬菌体可插入长达2000Obp的外源性DNA。 此外还有粘粒载体、单链丝状噬菌体等等
2．λ噬菌体。λ噬菌体的基因组是一组长度约为 50kb的双链DNA分子。在λ噬菌体颗粒内，该DNA为一双 链分子，其末端为长12个核苷酸的互补单链(粘端)。当 λ噬菌体进入宿主细胞后，其粘端通过碱基配对而结合 ，形成环状分子，相隔12bp有两个交错切口。宿主体内 的DNA连接酶很快将切口封闭而形成闭环DNA分子，该DNA 分子在感染早期充当转录模板。实验用λ噬菌体，在其 DNA的中部有一可取代区，含多克隆位点，供插入DNA之 用。λ噬菌体较质粒的优点在于可插入较大的DNA片段， 如有的λ噬菌体可插入长达20000bp的外源性DNA。 此外还有粘粒载体、单链丝状噬菌体等等
pbN标-1 MCS (reading irame非 htnf inre 面国虹g4因A底江艺E的A花苹A4A Ang' Unpurified PCR product PDNR-2 MCS ireading frame Zh" Ligate into pT-Adv pDNR-1.Z3 豆出A死EM匹应G的步A M 0Ng-3MC5 eading frame3非· Col El lacza 点aE6 ACDAGEATA道边AA打IAA年药A4 t pT-Adv 3.9kb Amp' B-Galactosidase Kan' 6 950InW SSSInW Transform TOP10F cells plate on LB/X-gal/PTG with amp or kan 用裂 d857(nin5) FIGURE 2 Map of the Uni-ZAP XR insertion vector 左上：质粒载体。左下：噬菌体载体。右质粒重组示意图
左上：质粒载体。左下：λ噬菌体载体。右质粒重组示意图